第五章-色譜分析法概論課件

§15-1概述一、“色譜法”名稱的由來石油醚(流動相)碳酸鈣(固定相)}色譜帶§15-1概述一、“色譜法”石油醚(流動相)碳酸鈣}色1是利用混合物不同組分在固定相和流動相中分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、滲透性等)的差異，使不同組分在作相對運動的兩相中進行反復分配，實現(xiàn)分離的分析方法。色譜法是利用混合物不同組分在固定相和流動相中分配系數(shù)(或吸附系數(shù)、2二、色譜法的分類根據(jù)流動相的物態(tài)可分為氣相色譜(GC)液相色譜(LC){氣-固色譜(GSC)氣-液色譜(GLC)液-固色譜(LSC)液-液色譜(LLC)二、色譜法的分類根據(jù)流動相的氣相色譜(GC){氣-固色譜(3按固定相的固定方式分類柱色譜平板色譜平板色譜填充柱色譜毛細管柱色譜紙色譜薄層色譜按固定相的固定方式分類柱色譜平板色譜填充柱色譜紙色譜4根據(jù)分離機理可分為吸附色譜分配色譜離子交換色譜排阻色譜根據(jù)分離機理吸附色譜5色譜法的特點和應用1.分離效能高2.靈敏度高可檢測10-11~10-13g,適于痕量分析.色譜分析需試樣量極少(g或ng).3.分析速度快4.應用范圍廣 缺點：對未知物的定性分析比較困難。方向：高選擇性檢測器；聯(lián)用技術（GC-MS、GC-FTIR、LC-MS、LC-NMR等）。色譜法的特點和應用1.分離效能高6一、分離原理特點：不同組分在柱中移動速度不等；各組分沿柱子擴散分布。§15-2色譜分離原理一、分離原理特點：不同組分在柱中移動速度不等；§15-2色71.分配系數(shù)（平衡常數(shù)）K

指在一定和溫度和壓力下，組分在兩相間達到分配平衡時，組分在固定相中的濃度cs與組分在流動相中的濃度cm之比。K：與溫度、壓力有關外，還與組分性質、固定相和流動相性質有關。

不同組分K值的差異，是實現(xiàn)色譜分離的先決條件。二、分配系數(shù)和容量因子1.分配系數(shù)（平衡常數(shù)）KK：與溫度、壓力有關外，還與82、容量因子（分配比）k

指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間達到分配平衡時，組分在固定相中的質量p與組分在流動相中的質量q之比。分配系數(shù)與容量因子關系：稱為相比2、容量因子（分配比）k 分配系數(shù)與容量因子關系：稱為相比9k'：與溫度、壓力有關外，還與組分性質、固定相和流動相性質及

有關。

K與k'是兩個不同的參數(shù)，但在表征組分的分離行為時，二者完全等效。k'可以方便地從色譜圖直接求得，所以它是一個重要的色譜參數(shù)。k'：與溫度、壓力有關外，還與組分性質、固定相和流動相性質10§15-3色譜圖及常用術語從載氣帶著組分進入色譜柱起就用檢測器檢測流出柱后的氣體，并用記錄器記錄信號隨時間變化的曲線，此曲線就叫色譜流出曲線。當待測組分流出色譜柱時，檢測器就可檢測到其組分的濃度，在流出曲線上表現(xiàn)為峰狀，叫色譜峰。§15-3色譜圖及常用術語從載氣帶著組分進入11第五章-色譜分析法概論課件12一、基線

當沒有待測組分進入檢測器時,在實驗操作條件下，反映檢測器噪聲隨時間變化的曲線稱為基線，穩(wěn)定的基線應該是一條水平直線。二、峰高

色譜峰頂點與基線之間的垂直距離，以（h）表示。一、基線13三、區(qū)域寬度

用于衡量柱效率及反映色譜操作條件的動力學因素。表示色譜峰區(qū)域寬度通常有三種方法:1)標準偏差

---即0.607倍峰高處色譜峰寬的一半。2)半峰寬Y1/2---即峰高一半處的峰寬度。它與標準偏差的關系為:Y1/2=2.354

3)峰底寬度Yb--即色譜峰兩側拐點上的切線在基線上截距間的距離。它與標準偏差

的關系是

Yb=4

三、區(qū)域寬度14四、保留值

1.保留值的定義(1)死時間tM

不被固定相吸附或溶解的物質進入色譜柱時，從進樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時間稱為死時間.L為柱長(cm)ū為流動相平均線速度(cm/s)(2)

保留時間tR

試樣從進樣到柱后出現(xiàn)峰極大點時所經(jīng)過的時間，稱為保留時間.四、保留值L為柱長(cm)(2)保留時間tR15(3)調整保留時間tR′

tR′=tR

tM

由于組分在色譜柱中的保留時間tR包含了組分隨流動相通過柱子所需的時間和組分在固定相中滯留所須的時間，所以tR′實際上是組分在固定相中保留的總時間。

保留時間是色譜法定性的基本依據(jù).

但同一組分的保留時間常受到流動相流速的影響，因此色譜工作者有時用保留體積來表示保留值。(3)調整保留時間tR′16(4)死體積VM

不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流動相的體積.VM=Fc·tM

Fc:流動相平均體積流速,（單位:cm3·min-1）.(5)保留體積VR

指從進樣開始到被測組分在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。保留時間與保留體積關系：

VR=Fc·tR(6)調整保留體積VR

某組分的保留體積扣除死體積后，稱為該組分的調整保留體積。

VR

=VR

VM=tR

Fc(4)死體積VM172.保留值與平衡常數(shù)K的關系根據(jù)物料平衡：兩邊同除以cm:平衡常數(shù)K＝cs/cm，且Vm≈VM:或:該式是色譜過程的基本方程，它將反映色譜行為的保留值（VR、V'R、VM）與反映物質性質的熱力學常數(shù)K聯(lián)系起來。2.保留值與平衡常數(shù)K的關系根據(jù)物料平衡：兩邊同除以c18可得：

3.保留值與容量因子的關系將色譜過程基本方程代入：將該式改為：可得：3.保留值與容量因子的19

4.相對保留值

某組分2的調整保留值與組分1的調整保留值之比，稱為相對保留值。 由于相對保留值只與柱溫及固定相性質有關，而與柱徑、柱長、填充情況及流動相流速無關，因此，它在色譜法中，特別是在氣相色譜法中，廣泛用作定性的依據(jù)。在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值。

4.相對保留值20

在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對，將它們的相對保留值作業(yè)重要參數(shù)，稱選擇因子，用符號

表示，即 式中tR(2)為后出峰的調整保留時間，所以

總是大于1的。

可作為衡量固定相選擇性的指標。

越大，越容易分離。=1，分離不能實現(xiàn)。

在多元混合物分析中，通常選擇一對最難分離的物質對21

α是兩個組分平衡常數(shù)或容量因子之比，是兩組分在色譜體系中平衡分配差異的量度，是熱力學參數(shù)。它是柱溫、組分的性質、固定相和流動相的性質的函數(shù)。而與其它實驗條件，如柱徑、柱長、填充情況及流動相流速等無關。是廣泛使用的定性數(shù)據(jù)。α是兩個組分平衡常數(shù)或容量因子之比，是兩組分在色譜體22第五章-色譜分析法概論課件23從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：

(1)根據(jù)色譜峰的個數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個數(shù)；

(2)根據(jù)色譜峰的保留值，可以進行定性分析；

(3)根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可以進行定量分析；

(4)色譜峰的保留值及其區(qū)域寬度，是評價色譜柱分離效能的依據(jù)；

(5)色譜峰兩峰間的距離，是評價固定相（或流動相）選擇是否合適的依據(jù)。從色譜流出曲線中，可得許多重要信息：24

下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處的濃度輪廓。

濃度沿柱移動距離LABABKA>KB若要使A、B組分完全分離，必須滿足以下三點：第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異；第二，區(qū)域擴寬的速率應小于區(qū)域分離的速度；第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長的色譜柱?！?5-4色譜法基本理論下圖是A、B兩組分沿色譜柱移動時，不同位置處25

第一、二點是完全分離的必要條件。作為一個色譜理論，它不僅應說明組分在色譜柱中移動的速率，而且應說明組分在移動過程中引起區(qū)域擴寬的各種因素。塔板理論和速率理論均以色譜過程中分配系數(shù)恒定為前提，故稱為線性色譜理論。第一、二點是完全分離的必要條件。作為一個色譜理論，261塔板理論把色譜柱比作一個精餾塔，即色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平塔板組成。每一塊塔板的高度用H表示，稱為塔板高度，簡稱板高。 塔板理論假設：在每一塊塔板上，溶質在兩相間很快達到分配平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉移。對一根長為L的色譜柱，溶質平衡的次數(shù)應為：

n稱為理論塔板數(shù)

n越大或H越小,柱效率越高,分離能力越強.

1塔板理論27

塔板理論指出：第一，當溶質在柱中的平衡次數(shù)，即理論塔板數(shù)n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。在色譜柱中，n值一般很大，如氣相色譜柱的n

約為103-106

，因而這時的流出曲線可趨近于正態(tài)分布曲線。第二，當樣品進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數(shù)有微小差異，經(jīng)過反復多次的分配平衡后，仍可獲得良好的分離。第三，n與半峰寬及峰底寬的關系式為：

式中tR

與Y1/2

(Yb

)應采用同一單位（時間或距離）。

tR

一定時，色譜峰越窄，n越大，H越小，柱效能越高。塔板理論指出：28

在實際工作中，計算出來的

n

和H值有時并不能充分地反映色譜柱的分離效能，因為采用tR計算時，沒有扣除死時間tM，所以常用有效塔板數(shù)n有效表示柱效：有效板高： 在實際工作中，計算出來的n和H值有時并不能充分地反29用熱力學的觀點闡明了溶質在色譜柱中的分配平衡和分離過程解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置提出了計算和評價柱效的參數(shù)一種半經(jīng)驗性的平衡理論塔板理論貢獻缺點不能解釋造成譜帶擴張的原因和影響板高的各種因素不能說明同一溶質為什么在不同的流速下，可以測得不同的理論塔板數(shù)用熱力學的觀點闡明了溶質在色譜柱中的分配平衡和分離過程一種半302速率理論

1956年荷蘭學者vanDeemter（范第姆特）等在研究氣液色譜時，提出了色譜過程動力學理論——速率理論。他們吸收了塔板理論中板高的概念，并充分考慮了組分在兩相間的擴散和傳質過程，從而在動力學基礎上較好地解釋了影響板高的各種因素。該理論模型對氣相、液相色譜都適用。2速率理論31

vanDeemter方程的數(shù)學簡化式為

ū為流動相的平均線速度，單位：cm/s；

A、B、C、為常數(shù)，分別代表渦流擴散系數(shù)、分子擴散項系數(shù)、傳質阻力項系數(shù)。第五章-色譜分析法概論課件32（1）渦流擴散項

A

在填充色譜柱中，當組分隨流動相向柱出口遷移時，流動相由于受到固定相顆粒障礙，不斷改變流動方向，使組分分子在前進中形成紊亂的類似渦流的流動，故稱渦流擴散。

A=2λdp

dp:填充物的平均直徑

λ:填充不規(guī)則因子，

A與流動相的性質、線速度和組分性質無關。

對于空心毛細管，不存在渦流擴散，因此A=0。（1）渦流擴散項AA=2λdp33(2)

分子擴散項—B/ū

（縱向擴散項）：彎曲因子，填充柱色譜，<1。Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2·s-1）。與組分性質、載氣性質、柱溫、柱壓等因素有關。宜采用相對分子質量較大的載氣（如N2），較高載氣線速度，較低柱溫。(2)分子擴散項—B/ū（縱向擴散項）：34(3)傳質阻力項Cū

物質系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生的物質遷移過程，稱為傳質。影響該過程的阻力，稱為傳質阻力。 傳質阻力系數(shù)C包括氣相傳質阻力系數(shù)Cg和液相傳質阻力系數(shù)C1兩項，即

C=Cg+C1

(3)傳質阻力項Cū35將上面式總結，即可得氣液色譜板高方程

這一方程對選擇色譜分離條件具有實際指導意義，它指出了色譜柱填充的均勻程度，填料顆粒的大小，流動相的種類及流速，固定相的液膜厚度等對柱效的影響。將上面式總結，即可得氣液色譜板高方程這一方程對36

Ⅰ項，Hed，渦流擴散項。Ⅱ項，Hmp，流動區(qū)域內，流動相傳質阻力。Ⅲ項，Hld，分子擴散項，通?？梢院雎?。Ⅳ項，Hsm，流動相停滯區(qū)域內的傳質阻力項。Ⅴ項，Hsp，固定相傳質阻力，與氣相色譜中液相傳質阻力項相應。液相色譜中的速率理論

液液色譜的VanDeemter方程式可表達為：

ⅠⅡⅢⅣⅤⅠ項，Hed，渦流擴散項。液相色譜中的速率理論ⅠⅡⅢⅣⅤ37由上式可知，在液液色譜中提高柱效可采用以下方法：1、減小填料顆粒粒度dp；2、用黏度較低的溶劑作流動相；3、采用低流速流動相；4、減小填料空穴深度；5、適當提高柱溫。由上式可知，在液液色譜中提高柱效可采用以下方法：38

§15-5

分離度1、柱效和選擇性

理論塔板數(shù)n是衡量柱效的指標，反映了色譜分離過程動力學性質。

選擇性因子

是衡量色譜柱選擇性的指標，取決于組分在固定相上的熱力學性質。2、分離度的定義 分離度又叫分辨率或分辨度，既能反映柱效率又能反映選擇性的指標，是衡量分離效能的總指標。

定義：或§15-5分離度1、柱效和選擇性或39不同分離度時色譜峰分離的程度一般說，當Rs<1時，兩峰有部分重疊；當Rs=1時，分離程度可達98%；當Rs=1.5時，分離程度可達99.7%。

通常用Rs=1.5作為相鄰兩組分已完全分離的標志。不同分離度時色譜峰分離的程度一般說，當Rs<1時，兩峰有部分403分離度的公式

分離度概括了色譜過程動力學和熱力學特性，是衡量色譜術分享效能的總指標。分離度受n、α和k'三個參數(shù)的控制。設有兩相近色譜峰A、B，同時假設Wb(A)=Wb(B)。

由tR(A)=tM(1+k'A）tR(B)=tM(1+k‘B）而基本色譜分離方程式3分離度的公式基本色譜分離方程式41(1)分離度與柱效的關系

增加柱長，可提高分離度，但延長了分析時間，因此降低板高，提高柱效，才是提高分離度的好方法。(1)分離度與柱效的關系 增加柱長，可提高分離度，但延長了分42(2)分離度與選擇因子的關系 當

=1時，R=0，這時，無論怎樣提高柱效也無法使兩組分分離。顯然，

大，選擇性好。研究證明

的微小變化，就能引起分離度的顯著變化。如達到相同分離度，當＝1.01時，所需時間是＝1.1時的84倍。

一般通過改變固定相和流動相的性質或降低柱溫，可有效增大

值。(2)分離度與選擇因子的關系43(3)分離度與容量因子的關系一般取k為2~10最宜。對于GC，通過提高溫度，可選擇合適的k'值，以改進分離度。而對于LC，只要改變流動相的組成，就能有效地控制k'值。它對LC的分離能起到立竿見影的效果。(3)分離度與容量因子的關系一般取k為2~144§15-6色譜定性和定量分析一定性分析1用已知純物質對照定性單柱比較法雙柱比較法峰高增加法定性§15-6色譜定性和定量分析一定性分析1用已知純物質452相對保留值它僅隨固定液及柱溫變化而改變，與其它操作條件無關。2相對保留值它僅隨固定液及柱溫變化而改變，46二定量分析定量基礎或二定量分析定量基礎或471、響應信號的測量（1）對稱形峰面積的測量——峰高乘以半峰寬法

A=1.065hW1/2（2）不對稱形峰面積的測量——峰高乘以平均峰寬法

A=1/2

h（W0.15+W0.85）（3）自動電學積分儀（4）用峰高表示峰面積 在痕量分析中，峰高法的準確度較高。峰面積法適用于各種形狀的峰，精度較好。

峰面積的大小不易受操作條件如柱溫、流動相的流速、進樣速度等的影響，故適于作定量分析的參數(shù)。1、響應信號的測量482、校正因子

（1）絕對校正因子

受儀器及操作條件