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非那西丁體外溫孵實(shí)驗(yàn)成員:非那西丁體外溫孵實(shí)驗(yàn)成員:1
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定方法的建立。2.熟練操作HPLC。3.了解肝微粒體。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定方2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.建立非那西丁體外溫孵實(shí)驗(yàn)測定其代謝速率的實(shí)驗(yàn)方案。2.開發(fā)大鼠肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚測定的方法,制備對乙酰氨基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并采用HPLC法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線用于肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.建立非那西丁體外溫孵實(shí)驗(yàn)測定其代謝速率的實(shí)驗(yàn)方案3肝微粒體簡介肝細(xì)胞內(nèi)還含有肝微粒體,是藥物代謝及生物轉(zhuǎn)化的重要場所。肝微粒體實(shí)質(zhì)上由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片和核糖核酸顆粒組成。內(nèi)含多種與過氧化氫有關(guān)的酶系,又稱過氧小體,內(nèi)含膽固醇合成酶系,類固醇,膽紅素和藥物結(jié)合酶系,以及與藥物代謝有關(guān)的酶系,可使脂溶性藥物代謝成水溶性藥物,經(jīng)腎臟排泄。肝微粒體受到損害時,藥物代謝發(fā)生障礙,藥物作用時間延長。制備肝微粒體的方法有超速離心法、鈣沉淀法、聚乙二醇法等。肝微粒體簡介肝細(xì)胞內(nèi)還含有肝微粒體,是藥物代謝及生物轉(zhuǎn)化的重4
實(shí)驗(yàn)過程一、肝微粒體溫孵液的制備。
肝微粒體的制備方法:1.取大鼠禁食24h,斷頭處死放盡血液,迅速剖開腹腔取出肝臟,剪碎肝組織,用預(yù)冷的Tris緩沖液洗凈血污,再用濾紙吸干表面水分后稱重,按1:3加入PBS后,加水至1000ml,冰浴,用玻璃勻漿器制成肝勻漿,于4°C,12500r離心20min,取上清液,與88mmol/LCaCl2混勻,4°C27000離心20min,取沉淀,再用0.1mmol/LTris緩沖液沖洗,4°C27000離心緩沖20min,取沉淀。實(shí)驗(yàn)過程一、肝微粒體溫孵液的制備。5實(shí)驗(yàn)過程2.重懸沉淀
將沉淀物懸浮于含20%甘油的磷酸鉀緩沖液中(1g組織加入1ml含20%甘油的磷酸鉀緩沖液),反復(fù)在冰水浴中吹打均勻,凍存管分裝后置-80℃冰箱內(nèi)保存待用。3.蛋白定量
采用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)過程2.重懸沉淀
6二、溫孵實(shí)驗(yàn)。肝微粒體(0.2mg/mL,80μL),非那西丁溶液(5,7.5,10,15,20,25,30,40,60,80,100μmol/L),100mmol/L磷酸鉀緩沖(pH7.4)37℃水浴預(yù)溫孵5min。加入NADPH體系溶液(10mmol/L葡糖-6-磷酸、1U·m/L葡糖-6-磷酸脫氫酶,4mmol/L氯化鎂,啟動劑,40μL),在37℃水浴溫孵30min后,
加入冰甲醇(終止試劑,100μL),終止溫孵。實(shí)驗(yàn)過程二、溫孵實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程7實(shí)驗(yàn)過程(為了考察大鼠微粒體反應(yīng)中合適的終止試劑,對冰甲醇和冰乙腈的終止效果進(jìn)行比較分析。發(fā)現(xiàn)選用冰乙腈作為終止試劑時,對乙酰氨基酚出峰位置存在干擾,而選用冰甲醇時,無內(nèi)源性干擾,因此選用冰甲醇作為終止試劑。)4℃下12000r/min離心15min,取上清液40μL進(jìn)行HPLC分析。
實(shí)驗(yàn)過程(為了考察大鼠微粒體反應(yīng)中合適的終止試劑,對冰甲醇和8實(shí)驗(yàn)過程三、HPLC測定肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度。色譜條件:ShimadzuShim-PackVP-ODS柱(150mm×4.6mm,5μm)流速:1.0mL/min柱溫:室溫檢測波長:245nm采用梯度洗脫:流動相A為100mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH4.3),B為乙腈。0~12min,A—B(90∶10),12~17min,A—B(75∶25),17~29min,A-B(75∶25),29~35min,A-B(90∶10),35~40min,A-B(90∶10)實(shí)驗(yàn)過程三、HPLC測定肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度。9HPLC四、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線與測定非那西丁體外溫孵液代謝速率。HPLC四、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線與測定非那西丁體外溫孵液代謝速率。10建立對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線取對乙酰氨基酚儲備液,已含有失活微粒體的甲醇水溶液(1∶1)稀釋成0.2,1,2,5,10,20μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)微粒體樣品,分別加入等體積的內(nèi)標(biāo)(10μmol/L間乙酰氨基酚),取20μL按照色譜條件進(jìn)行HPLC分析,測定對乙酰氨基酚含量。以對乙酰氨基酚與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),對乙酰氨基酚濃度(X,μmol/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線取對乙酰氨基酚儲備液,已含有失活微粒11數(shù)據(jù)處理記錄HPLC中對乙酰氨基酚和間乙酰氨基酚的峰面積,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出產(chǎn)物中對乙酰氨基酚濃度,以非那西丁濃度與對乙酰氨基酚的生成速率繪制曲線。通過米氏方程V=
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