結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法及評(píng)價(jià)

結(jié)核病的試驗(yàn)室診斷方法及評(píng)價(jià)耐多藥結(jié)核病的試驗(yàn)室診斷條件：因耐多藥結(jié)核分枝桿菌的生物危急性，需P2及以上試驗(yàn)室，目前我院試驗(yàn)室條件根本具備馬上投入運(yùn)行，日常培育及涂片用的生物安全柜濾膜已超出訪用年限，工作人員生物安全得不到保障，應(yīng)定期予以更換。耐多藥結(jié)核分枝桿菌主要以結(jié)核分枝桿菌體外藥物敏感性測(cè)定作為其診斷依據(jù)。因此其根底是培育，只有培育出陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌才能進(jìn)一步通過結(jié)核分枝桿菌體外藥物敏感性測(cè)定診斷是否為耐多藥結(jié)核分枝桿菌。已進(jìn)人臨床常規(guī)應(yīng)用的測(cè)定方法:目前包括確定濃度法、比例法BACTEC460、BACTEC960、BacT/ALERT3D、ESPII系統(tǒng)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性。其中:確定濃度法以最低抑菌濃度或以無生長(zhǎng)為終點(diǎn)作為推斷標(biāo)準(zhǔn)，是我國(guó)目前普遍承受的方法;比例法以是否能夠抑制99%的細(xì)菌生長(zhǎng)作為推斷標(biāo)準(zhǔn)，是世界衛(wèi)生組織推舉使用的方法;后四種儀器方法則是比例法的特化，其特點(diǎn)是以細(xì)菌的代謝過程指示細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。處于爭(zhēng)論探究階段的測(cè)定方法:此類方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌體生物擴(kuò)增法、液體變色培育基測(cè)定法、熒光素酶測(cè)定法、硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)等。3分子生物學(xué)方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)已有一些進(jìn)入臨床檢測(cè)?；蛲蛔兪且鹂菇Y(jié)核藥物耐藥性的最主要的緣由。多種以PCR為根底的分子生物學(xué)技術(shù)用于檢測(cè)與耐藥相關(guān)基因的突變，作為快速耐藥性檢測(cè)方法在試驗(yàn)室或臨床得到開展。這些方法具體包括：主要是DNA序列分析法，聚合鏈反響-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析〔PCR-SSCP〕，另外還包括基因芯片技術(shù)、異質(zhì)性雙鏈構(gòu)象分析、變性梯度凝膠電泳、線性探針雜交技術(shù)、RNA/RNA錯(cuò)配檢測(cè)技術(shù)和分子燈塔技術(shù)等。由于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性與基因突變的精準(zhǔn)關(guān)系未完全說明，檢測(cè)耐藥相關(guān)基因的分子生物學(xué)方法雖然能快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到耐藥相關(guān)基因的突變，但由于推斷藥物敏感性時(shí)存在固有的缺陷，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的基因型鑒定法不能完全替代表型鑒定法。結(jié)核病的試驗(yàn)室診斷方法及評(píng)價(jià)(一)標(biāo)本的采集痰標(biāo)本采集發(fā)病人應(yīng)在抗結(jié)核藥物治療前留取痰標(biāo)本。治療中的病人應(yīng)停藥2～3天后留取痰標(biāo)本。病人于早晨漱口后，留取3～5ml合格的痰標(biāo)本(深咳后吐出的黏液痰、膿樣痰、干酪樣痰、褐色血樣痰或含少量穎血液的血痰)，遇到唾液或口永，應(yīng)重留取。至少采集3次。WHO推舉的采集容器為國(guó)際通用的螺旋蓋痰瓶、可密封塑料盒或蠟紙盒。痰容器上應(yīng)標(biāo)明病人姓名、編號(hào)、檢查工程和容器序號(hào)。胃沖洗液幼兒不會(huì)吐痰，常將痰液咽下，故可用早晨空腹胃洗出液，直接涂片染色或進(jìn)展結(jié)核桿菌培育，連續(xù)作三次可提高培育陽(yáng)性率。胃液結(jié)核桿菌檢出率以浸潤(rùn)性肺結(jié)核和干酪性肺炎為最高，其次為粟粒型肺結(jié)核。胃液、痰液或其他分泌物中結(jié)核桿菌檢查，有時(shí)對(duì)診斷有打算性意義。支氣管肺泡灌洗和支氣管沖洗支氣管肺泡灌洗和支氣管沖洗液5ml病灶組織或干酷塊等先用組織研磨器磨碎后再行涂片。尿液留全量夜尿，靜置4或5小時(shí)后，棄上清液，取沉淀局部10ml，3000rpm30min，取沉渣涂片。體液或腦脊液無菌操作收集體液或腦脊液，放置冰箱或室溫24h，待薄膜形成后涂片。也可將腦脊液離心沉淀，3000rpm，離心30min，棄上清液，取沉淀物涂片。(二)試驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)1．細(xì)菌學(xué)診斷方法涂片檢查法：包括直接涂片法、熒光染色涂片法和集菌涂片琺。痰液、膿液可直接涂片。用萋爾-尼爾遜染色法(Ziehi-Neelsen)簡(jiǎn)稱萋尼染色法，假設(shè)鏡檢找到抗酸性桿菌，則可能是結(jié)核桿菌。此法簡(jiǎn)便、快速，技術(shù)要求低，無需特別儀器且能當(dāng)天出結(jié)果，格外經(jīng)濟(jì)，符合我國(guó)國(guó)情。但其敏感性差，一般需5000～10000條菌／ml才能得到陽(yáng)性結(jié)果；特異性差，各種分枝桿菌均可著色，要進(jìn)一步鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌；不能區(qū)分死菌與活菌?！据履崾先旧ā竣偻科喝〗?jīng)95％乙醇擦拭脫脂過的枯燥、清潔、無油污、無劃痕的玻璃片(玻片不能重復(fù)使用)，于玻片反面的左端1／3處以藍(lán)色或黑色記號(hào)筆(玻璃鉛筆)編號(hào)。用接種環(huán)挑取痰標(biāo)本的膿樣，干酪樣局部約0.05～0.1ml，于玻片正面的右側(cè)23處，均勻涂沫成10mm×20mm②試劑：⊙堿性復(fù)紅乙醇染色儲(chǔ)存液：堿性復(fù)紅液：895％乙醇100ml中。5％石碳酸水溶液：5克石碳酸溶于100ml蒸餾水中。③染色步驟；【熒光染色法】①試劑：染色劑z金胺“O”0．1g溶于95％乙醇10ml，加5％石炭酸90ml。脫色劑：3％鹽酸乙醇液。復(fù)染劑：0.5％高錳酸鉀水溶液。②染色步驟：③鏡檢與報(bào)告方式：在暗色背景下，抗酸桿菌呈黃綠色或橙色熒光。必需用40×物鏡確認(rèn)菌體形態(tài)，應(yīng)具有萋-納氏抗酸染色鏡經(jīng)檢驗(yàn)后，方可應(yīng)用熒光染色法，留意勿過讀或漏判。熒光染色后涂片應(yīng)在24h4℃保存，次日完成鏡檢。物鏡20×檢查結(jié)果按以下標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告：陰性(-)：050可疑(+)；1～3條／50視野陽(yáng)性(1+)：l1～99條／50視野(2+)：1～9(3+)：10～99(4+)：≥100物鏡40×檢查細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。常規(guī)培育法：結(jié)核分枝桿菌培育陽(yáng)性是確診結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。改進(jìn)羅氏培育法是目前較為成熟的分別培育方法，依據(jù)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)緩慢，菌落枯燥、顆粒狀、乳酪色像菜花狀，菌體染色抗酸性強(qiáng)等特點(diǎn)推斷是否為結(jié)核桿菌。如菌落、菌體染色都不典型,則可能為非典型分枝桿菌，應(yīng)進(jìn)一步作鑒別試驗(yàn)。此法培育時(shí)間長(zhǎng)，不適于快速檢測(cè)結(jié)核桿菌，且陽(yáng)性率也只有30％～40％，使大量結(jié)核病人漏診或誤診。同時(shí)各種分枝桿菌均可生長(zhǎng)，也需進(jìn)一步鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌?！雅嘤Y(jié)果報(bào)告方式：抗酸桿菌培育陰性：斜面無菌落生長(zhǎng)?？顾釛U菌培育陽(yáng)性(1+)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1／4?？顾釛U菌培育陽(yáng)性(2+)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的1／2。抗酸桿菌培育陽(yáng)性(3+)：菌落生長(zhǎng)占斜面面積的3／4。抗酸桿菌培育陽(yáng)性(4+)：菌落生長(zhǎng)布滿全斜面?？顾釛U菌培育陰性應(yīng)以“(培育陰性)”報(bào)告。菌落生長(zhǎng)缺乏以斜面面積1／4時(shí)，實(shí)報(bào)菌落數(shù)?？焖倥嘤ǎ孩貰actecMGIT960分枝桿菌快速培育、藥敏檢測(cè)系統(tǒng)的根本原理是，其所使用的培育瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當(dāng)分枝桿菌生長(zhǎng)使氧消耗后，熒光顯示劑被激活而發(fā)出熒光。檢測(cè)系統(tǒng)每隔60分鐘連續(xù)測(cè)定培育管內(nèi)熒光強(qiáng)度，來推斷管內(nèi)分枝桿菌生長(zhǎng)狀況。②BacTALERT3D培育系統(tǒng)：是另一類分枝桿菌快速培育、藥敏檢測(cè)系統(tǒng)，也可用于一般細(xì)菌的培育。其原理是所使用的培育瓶底部，有顏色感應(yīng)器，當(dāng)分枝桿菌在瓶中生長(zhǎng)，有CO2產(chǎn)生時(shí)，顏色感應(yīng)器由綠色變?yōu)辄S色。系統(tǒng)自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，依據(jù)計(jì)算結(jié)果自動(dòng)顯示有無分枝桿菌生長(zhǎng)。此法無放射性，顯著縮短培育時(shí)間，且操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化強(qiáng)，還可進(jìn)展快速菌型鑒定。但液體培育基中不能觀看菌落形態(tài)，儀器與試劑價(jià)格較貴。液體變色培育基(MBRedox系統(tǒng))：該系統(tǒng)由改進(jìn)米氏7H9培育基、促生長(zhǎng)添加劑(血清、復(fù)合維生素等)、抗生素混合物PACT(多黏菌素B、兩性霉素B、茶啶酸、甲氧芐胺嘧啶)和氧化復(fù)原顯示器(即無色四鎓鹽)組成。促生長(zhǎng)添加劑可加速分枝桿菌的生長(zhǎng)和甲臜(formazan)的形成。其原理是當(dāng)分枝桿菌在此培育基生長(zhǎng)時(shí)，通過氧化復(fù)原系統(tǒng)，使培育基中的無色四唑鎓鹽復(fù)原成粉紅色、紅色或紫色甲臜。由于甲臜不溶于水．以顆粒形式分泌到細(xì)胞外表，分枝桿菌菌落就變成了用肉眼可見的紅或紫色，取培育液涂片，染色鏡檢。此法操作簡(jiǎn)便，培育時(shí)間短，肉眼觀看結(jié)果，無需特別儀器，無放射性污染，還可用于分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)和菌種鑒定。但陽(yáng)性率還不夠高，結(jié)果觀看存在主觀性。噬菌體裂解試驗(yàn)：由于恥垢分枝桿菌噬菌體是一種DNA病毒，能特異感染相應(yīng)的活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)快速增殖?裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，又可感染隨后參與的指示細(xì)胞(也是一種分枝桿菌)，并使指示細(xì)胞裂解，在培育平板上消滅噬菌斑。依據(jù)噬菌斑的有無，即可確定待檢標(biāo)本中是否含有相應(yīng)的活的分枝桿菌。此方法簡(jiǎn)便、快速，不需特別儀器；特異性和靈敏度較高；檢測(cè)的是活菌，但傳染性?。豢上鄬?duì)定量可測(cè)定藥物敏感性。其主要步驟為：①標(biāo)本前處理：同常規(guī)培育法(假設(shè)用菌株則勿需此步)，經(jīng)前處理后的標(biāo)本于Middlebrook7H9培育基中(含有改進(jìn)的OADC養(yǎng)分添加劑)37℃溫育24h。②噬菌體浸染：取0.5ml上述處理后的樣品(或菌液)，參與0．1ml分枝桿菌噬菌體，震蕩混勻，37℃孵育1b。③中止浸染：于上述浸染液中加人0.1ml殺毒劑，徹底混勻，室溫作用5min，參與5mlMiddlebrook7H9培育液和1ml指示細(xì)胞。④澆注平皿和培育：將上述混合培育液與5ml溶化的瓊脂共同傾注于無菌平皿中，旋轉(zhuǎn)混勻，靜置成形后，于37℃培育18～24h。每次檢測(cè)同時(shí)設(shè)空白比照、嘴菌體比照、殺毒劑比照、指示細(xì)胞比照和陰性及陽(yáng)性比照。⑤結(jié)果觀看：在各比照組結(jié)果正確的條件下，觀看試驗(yàn)樣品結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果可見有大小和數(shù)量不等的噬菌斑消滅(彩圖2)，或很多嘴菌斑相互融合成透亮狀；陰性結(jié)果可見指示細(xì)胞在瓊脂培育基中均勻生長(zhǎng)．無噬菌斑消滅。常用的免疫學(xué)診斷方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymeLinkedimmunosorbentas-say，ELISA)：ELISA爭(zhēng)論和應(yīng)用報(bào)道最多的試驗(yàn)方法。①ELISA間接法：其根本原理是吸附在固相載體上的結(jié)核抗原可與待檢標(biāo)本中的結(jié)核抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，后者與酶標(biāo)記的抗人IgG結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，酶使底物顯色。顏色的深淺與待檢標(biāo)本中的結(jié)核抗體含量成正比。本法主要用于測(cè)定結(jié)核抗體。②雙抗體夾心ELISA：其原理是吸附在固相載體上的結(jié)核抗體可與待檢標(biāo)本中的結(jié)核抗原結(jié)合，形成抗體-抗原復(fù)合物，后者與酶標(biāo)記的結(jié)核抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，酶使底物顯色，顏色的深淺與待檢標(biāo)本中的結(jié)核抗原含量成正比。本怯主要用于特異性結(jié)核抗原的測(cè)定。③抗原競(jìng)爭(zhēng)ELISA：其原理是吸附在固相載體上的結(jié)核抗體，可與標(biāo)本中的待檢結(jié)核抗原及同時(shí)參與的酶標(biāo)的結(jié)核抗原發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，形成抗體抗原和抗體-酶標(biāo)抗原兩種復(fù)合物，后者可使酶作用的底物顯色，顏色的深淺與待檢標(biāo)本中結(jié)核抗原的含量成反比。本法主要用于小分子抗原的測(cè)定。生物素-親和素-酶免疫測(cè)定法(biotin-avidin-system，BAS-酶免法)：根本原理類似于ELISA，只是用BAS來標(biāo)記酶，而不是用抗體或抗原標(biāo)記酶。BAS有三種根本測(cè)定方法，分別稱ABC法(avindin-biotin-complex)。BA法(biotin-avidin)和BAB法(bridged-avdin-biotintechnique)。前二種方法主要用于結(jié)核抗體或抗原的測(cè)定，BAB斑點(diǎn)酶免疫滲透試驗(yàn) (dotimmunoenzymefiltrationassav，DIEFA)：是在酶免疫結(jié)合試驗(yàn)根底上進(jìn)展起來的一種固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。其原理是利用微孔膜的可濾過性，使反響溶液自膜上快速通過，從而完成抗原、抗體的快速測(cè)定。本法包被所需的抗原量少，預(yù)先包被、封閉、枯燥后可長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。敏感性和特異性與ELISA法相當(dāng)。但操作更簡(jiǎn)潔，反響更快速，價(jià)格較廉價(jià)，結(jié)果只需肉服觀看，無需特別儀器，重復(fù)性好。斑點(diǎn)免疫金結(jié)合試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassayDIGFA)：根本步驟為：本法用膠體金標(biāo)記抗人IgG，由于膠體金本身呈紅色，不需再加顯色底物，陽(yáng)性反響即為紅色斑點(diǎn)。比ELlSA法削減了參與底物和終止液的步驟，操做更為簡(jiǎn)便快速；本法在可濾過性膜上進(jìn)展抗原、抗體反響，反響時(shí)間僅為3～5min；金標(biāo)試劑比酶標(biāo)試劑穩(wěn)定，室溫保存時(shí)間較長(zhǎng)。②斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)(dotimmunochromatographicassavDICA)：DICA的反響物與DIGFA根本一樣，反響物固定在一狹長(zhǎng)的微孔膜上，制成單一試劑形式，反響利用膜的毛細(xì)管作用進(jìn)展。微孔膜A端含有枯燥的金標(biāo)抗人IgG，中段點(diǎn)有特異性結(jié)核抗原，末段點(diǎn)有人IgG。僅需少量待檢血清(或其他體液標(biāo)本)滴在A端，并加人數(shù)滴稀釋液，使膜中的金標(biāo)抗人IgG溶解，假設(shè)待檢標(biāo)本中含有結(jié)核抗體特異性IgG即與金標(biāo)抗人I90結(jié)合形成復(fù)合物，并隨液體向前方移動(dòng)，至膜的中段時(shí)即與結(jié)核抗原結(jié)合，形成抗原抗體金標(biāo)抗體復(fù)合物，消滅紅色條帶為陽(yáng)性結(jié)果。如待檢樣品中不含結(jié)核抗體，則在測(cè)試區(qū)不消滅條帶。液體連續(xù)往前移動(dòng)，并在末段的試劑質(zhì)控區(qū)與正常人IgG結(jié)合，形成Igo金標(biāo)抗人IgG復(fù)合物，消滅紅色條帶，證明試劑反響系統(tǒng)正常。DICA測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速，在結(jié)核抗體檢測(cè)中受到廣泛關(guān)注。免疫印跡技術(shù)(immunoblotting或Westernblot)；是高分別SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-)與高敏感性酶聯(lián)反響相結(jié)合的一種檢測(cè)技術(shù)。包括SDS-、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印和固相酶免疫測(cè)定三步。SDS-泳至固相膜上，并保持其原有的物質(zhì)類型和生物學(xué)活性不變，然后利用抗原-抗體特異性反響進(jìn)展檢測(cè)。通過該技術(shù)可以了解抗原抗體反響的數(shù)目、被識(shí)別的抗原電泳遷移率以及抗原抗體反響的強(qiáng)度，從而有助于抗體聯(lián)合檢測(cè)和抗原鑒定的爭(zhēng)論。目前，此技術(shù)已轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，只進(jìn)展后半步酶聯(lián)免疫反響，即可檢出待檢標(biāo)本中所含的多種結(jié)核桿菌多膚抗原成分的特異性抗體。此法敏感性和特異性很高，是很有進(jìn)展前景的測(cè)定技術(shù)，已廣泛用于科研，在臨床診斷活動(dòng)性結(jié)核病人也有很高的價(jià)值。分子生物學(xué)診斷核酸探針(nuclearacidprobe)：分枝桿菌的核酸探針有四種主要類型：cDNA或rRNADNA探針、克隆的DNA或PCR擴(kuò)增片段探針及寡核甘酸探針等。此法特異性強(qiáng)，可以鑒定不同種群的分枝桿菌，有助于肺結(jié)核的診斷和鑒別診斷，但其敏感性低，價(jià)格昂貴，不適用于日常臨床診斷工作。聚合酶鏈反響(poLymerasechainreationPCR)：主要依據(jù)DNA復(fù)制原理，其過程類似于體內(nèi)細(xì)胞分裂時(shí)DNA半保存復(fù)制過程。其擴(kuò)增的每一循環(huán)，包括模板變性、引物退火及延長(zhǎng)三個(gè)步驟。PCR技術(shù)關(guān)鍵是設(shè)計(jì)一對(duì)特異性DNA引物，該引物所引導(dǎo)的DNA擴(kuò)增序列，應(yīng)是結(jié)核桿菌獨(dú)有的，且是結(jié)核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測(cè)結(jié)果的特異性。PCR的靈敏度高，可達(dá)1個(gè)結(jié)核桿菌。能早期診斷結(jié)核菌血癥，在結(jié)核桿菌感染的早期，特別是在結(jié)核病灶通過血源性外傳播時(shí)，外周血中存在極少量的結(jié)核桿菌時(shí)，通過PCR就可以檢測(cè)到結(jié)核桿菌。檢測(cè)時(shí)間短，僅需2～4h。目前存在的最大問題是假陽(yáng)性率和假陰性率較高，造成假陽(yáng)性的最主要緣由是試驗(yàn)室污染。DNA序列測(cè)定：不僅能夠用于突變的檢測(cè)，而且能夠確定突變的部位與性質(zhì)，因此是檢測(cè)基因突變的最抱負(fù)方法，也是推斷突變的“金標(biāo)準(zhǔn)”和評(píng)價(jià)其他方法的參考方法。 DNA序列測(cè)定有多種方法．但PCR-DNA序列測(cè)定簡(jiǎn)便、快速，是最常用的測(cè)定方法，已在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因爭(zhēng)論中，得到廣泛應(yīng)用。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的自動(dòng)化、規(guī)?；?、商品化，以及本錢的降低，為今后分枝桿菌基因序列的信息爭(zhēng)論以及分枝桿菌菌種鑒定供給了便利條件?；蛐酒夹g(shù)：又稱DNA芯片技術(shù)，是近年進(jìn)展起來的進(jìn)展大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測(cè)的方法，是目前分子生物學(xué)最前沿的方法。原理是將多種探針分子固定于支持物上，與標(biāo)記樣品分子進(jìn)展雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度，獵取樣品分子的數(shù)量和序列信息。測(cè)定耐藥性的主要步驟為：①制備測(cè)定耐藥性的基因芯片；②獲待測(cè)樣品DNA并進(jìn)展PCR擴(kuò)增和標(biāo)記：③擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)樣制備的芯片進(jìn)展雜交、顯色；④掃描檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果判定。該法基于核酸雜交的技術(shù)，同時(shí)將大量探針固定于支持物上，所以一次可以對(duì)樣品大量序列進(jìn)展檢測(cè)和分析，它有技術(shù)操作簡(jiǎn)潔、自動(dòng)化程度高、序列數(shù)量大、檢測(cè)效率高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。但基因芯片的制備比較簡(jiǎn)潔，本錢較高，儀器設(shè)備也較貴，不適用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。目前，基因芯片技術(shù)已在結(jié)核分枝桿菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性測(cè)定及基因組比較分析爭(zhēng)論中得以應(yīng)用，其中尤以耐藥性測(cè)定最為引人關(guān)注。細(xì)胞因子檢測(cè)主要包括酶聯(lián)免疫吸附法〔 ELISA〕和固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)〔ELISPOT〕兩種。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，其中最主要的是IFN-γ。通過檢測(cè)IFN-γ濃度可對(duì)結(jié)核分枝桿菌埋伏感染及結(jié)核病的診斷供給參考。目前主要應(yīng)用于結(jié)核性漿膜炎的診斷。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDFELISPOT通過顯色反響，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清楚可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)展計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。流式細(xì)胞術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)的原理和步驟FCM用于結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)所承受的細(xì)胞染色法是乙酰乙酸熒光素〔FDA〕染色法。FDA是一種非極性非熒光物質(zhì)，它能通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和被動(dòng)集中的方式穿透分枝桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜?；畹姆种U菌胞質(zhì)中非特異性酯酶能夠快速水解外來的FDA成為游離熒光素，游離熒光素在菌體內(nèi)蓄積易被流式細(xì)胞儀測(cè)定；而死菌的活性酯酶削減，不能或僅能水解少量的 FDA，產(chǎn)生很少的游離熒光素。FCM通過測(cè)量熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)變，判定活菌或死菌，從而用于結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)。將確定量的結(jié)核分枝桿菌菌懸液參與到確定濃度抗結(jié)核藥物的液體培育基，37℃培育24h〔或48h〕；同樣數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌菌懸液參與到不含抗結(jié)核藥物的液體培育基中，37℃培育24h〔或48h〕作為質(zhì)控；取上述菌懸液參與到混有FDA的PH7.4的PBS中，37℃靜置30minFCMFCM隨機(jī)軟件對(duì)每min細(xì)胞數(shù)〔標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌數(shù)〕和平均熒光強(qiáng)度〔標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌熒光強(qiáng)度〕兩項(xiàng)參數(shù)進(jìn)展分析，從而對(duì)結(jié)果進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。蛋白芯片在結(jié)核分枝桿菌爭(zhēng)論中的應(yīng)用現(xiàn)有的結(jié)核蛋白芯片是以微孔濾膜為載體，將結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原如阿拉伯甘露糖〔LAM〕，38Kda蛋白和16Kda蛋白等固定在其外表，利用微孔濾膜的滲透、濃縮、分散作用，捕獲被檢樣品中的特異性抗體，使抗原抗體反響在固相膜上快速進(jìn)展，再以免疫金作為標(biāo)記物而直接在膜上顯色形成紫紅色的斑點(diǎn)。顯色后通過芯片識(shí)別系統(tǒng)進(jìn)展分析，判定結(jié)果用于該類細(xì)菌感染的臨床關(guān)心診斷。其特點(diǎn)是可對(duì)多種結(jié)核分枝桿菌抗原之抗體進(jìn)展同時(shí)篩查，便利、快速而又有較高的特異性與敏感性，對(duì)于痰涂陰性、無痰的、肺外結(jié)核病人的