地木耳乙醇提取物對大腸桿菌抑菌機理及化妝品的影響

地木耳乙醇提取物對大腸桿菌抑菌機理及化妝品的影響

又名地衣、地衣、地衣、地衣等。它是綠藻科的一種植物。這是一個觀珠藻的集體。海藻絲由50.170個營養(yǎng)成分組成。1材料和方法1.1枯草芽孢桿菌、金孢桿菌、紅藻桿菌、紅藻桿菌地木耳購于市場。試驗菌種有大腸桿菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillussabtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa）、白色念珠菌（Moniliaalbican）。1.2酵母提取物的制備LB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15～20g）：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、水1000mL、自然pH,121℃高壓蒸汽滅菌30min，備用。1.3方法1.3.1提取溶液，提取溶液將新鮮的地木耳洗凈，干燥粉碎；料液比1∶50用95%乙醇溶液在40℃條件下提取10h，抽濾，收集濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2g/mL左右，用弱堿性樹脂DEAE纖維素脫色，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?.3.2選擇最佳試驗菌將保存良好的菌種活化3次，采用抑菌圈法1.3.3最低抑制濃度測定用LB液體培養(yǎng)基將得到的地木耳乙醇提取物稀釋2、4、8、16、32、64倍，分別向其中等量接種0.1mLE.coli菌懸液，置于搖床中，37℃、170r/min培養(yǎng)過夜，各濃度分別做3組平行，培養(yǎng)后觀察并判定是否長菌（其中渾濁表示顯著長菌，澄清表示未長菌），確定最低抑制濃度（Minimalinhibitoryconcentration,MIC)1.3.4平板中央濃度的測定取50μLE.coli菌懸液涂布于LB固體平板中央。待LB固體平板將菌懸液吸收完全后，在平板中央分別貼上在稀釋倍數(shù)為2、4、8、16、32倍的地木耳乙醇提取物中浸泡1min的滅菌濾紙片，對照組貼無菌水浸泡1min后的濾紙片。將平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每個濃度梯度做3個平行。測量抑菌圈大小，確定地木耳乙醇提取物對E.coli的抑菌能力1.3.5地木耳乙醇提取物對a接種大腸桿菌到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床在37℃、170r/min條件下培養(yǎng)，接種2h后向試驗組加入地木耳乙醇提取物（濃度由“1.3.3”的結(jié)果確定），對照組加等量無菌水，同時加入等量等濃度地木耳乙醇提取物于空白培養(yǎng)基以消除地木耳乙醇提取物對A1.3.7上清溶液中的總糖含量試驗組和對照組操作同“1.3.5”。每隔一段時間取菌懸液離心，采用苯酚-硫酸法1.3.8上清液總蛋白質(zhì)的測定試驗組和對照組操作同“1.3.5”。每隔一段時間取菌懸液離心，采用考馬斯亮藍G-250法1.3.9地木耳護膚霜的制備1）地木耳保濕精華水的制備。原料組分按重量份數(shù)計為地木耳乙醇提取物4.0～8.0，甘油9.0～12.0，十六醇6.5～9.0，白油0.5～1.0，三乙醇胺0.5～0.8，羊毛脂0.1～0.2，尼泊金丙酯0.1～0.15，去離子水90～100，香精0.1～0.3。將甘油和去離子水恒溫水浴加熱至85℃左右，再向其中加入十六醇、白油、三乙醇胺和羊毛脂，加熱并攪拌至完全熔化。過濾并滅菌。溶液降至65℃左右時加入地木耳乙醇提取物和香精。溫度降至45℃時加入尼泊金丙酯，攪拌均勻后靜置，即得所需化妝品。2）地木耳護膚霜的制備。原料組分按重量份數(shù)計為地木耳乙醇提取物4.0～8.0，去離子水70～80，甘油6.5～10，十六醇5.0～7.5，白油3.0～4.0，硬脂酸4.5～6.5，羊毛脂1.0～2.0，三乙醇胺0.3～0.6，香精0.1～0.3，尼泊金丙酯0.1～0.15。將硬脂酸、白油、羊毛脂、三乙醇胺和十六醇置于燒杯中，80～90℃水浴加熱并攪拌至完全熔化，然后加入去離子水和甘油，充分攪拌后于45℃左右保溫20min。過濾并滅菌。于溫度降至65℃左右時加入地木耳乙醇提取物和香精。溫度降至45℃左右時再加入尼泊金丙酯，攪拌均勻后靜置，即得到所需化妝品。3）地木耳濕紙巾型面膜的制備。原料組分按重量份數(shù)計為地木耳乙醇提取物8.0～10.0，甘油6.0～7.0，十六醇5.5～7.0，羊毛脂2.5～3.0，白油0.5～1.0，無水乙醇2.0～3.0，三乙醇胺0.5～0.6，去離子水100～110，尼泊金丙酯0.1～0.15，香精0.1～0.3。將羊毛脂、十六醇、白油三乙醇胺在80～90℃下加熱攪拌至完全熔化，然后加入去離子水和甘油，45℃水浴保溫20min。過濾并滅菌。于溫度降至65℃左右時加入地木耳乙醇提取物和香精，繼續(xù)攪拌并加入尼泊金丙酯和無水乙醇，靜置，得到面膜液。將潔凈無菌的市售面膜紙浸潤于面膜液中，即得到所需化妝品1.3.1種化妝品的受試方法1）地木耳化妝品感官測試及pH測試。直接用目測法觀察化妝品色澤、氣味及膏體黏稠度、涂展性等性質(zhì)；使用pH計測定pH。2）地木耳化妝品穩(wěn)定性測試。各取2份5mL地木耳保濕精華水、5g地木耳滋潤霜、5mL面膜液。耐熱試驗：將3種化妝品中的試驗組樣品置于40℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，保溫24h后取出，恢復(fù)室溫后與置于室溫下24h的對照組樣品進行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。耐寒試驗：將3種化妝品中的試驗組樣品置于-20℃電冰箱內(nèi)，保持24h后取出，待樣品恢復(fù)室溫后與置于室溫下24h的對照組樣品進行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。冷熱交替循環(huán)試驗：將3種化妝品中的試驗組樣品置于40℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24h，取出在室溫下放置24h，再置于-20℃冰箱中冷凍24h。此步驟循環(huán)3次，最后與另1份置于室溫下的對照組樣品進行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層及硬度變化等現(xiàn)象發(fā)生。離心試驗：將3種化妝品中的試驗組樣品置于離心機中，2000～4000r/min離心30min后，取出與另1份置于室溫下的對照組樣品進行比較，觀察其是否有浮油、變色、變稀、分層等現(xiàn)象發(fā)生3）地木耳化妝品安全性測試——斑貼試驗。選擇18～60歲符合試驗要求的健康志愿者30名作為受試對象。選用市售合格斑試材料，將受試化妝品樣品放入斑試器內(nèi)，固體用量為0.03g，液體用量為0.03mL?？瞻讓φ湛撞惶砑尤魏挝镔|(zhì)。將斑試器（加有受試化妝品樣品）貼敷于受試者受試區(qū)域（前臂曲側(cè)或背部）保持24h。除去斑試器后，分別間隔30min、24h、48h觀察受試者皮膚反應(yīng)4）美白功效測試——酪氨酸酶抑制測試。黑色素合成途徑中的重要限速酶是酪氨酸酶，該酶通過影響酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴，多巴氧化為多巴醌來影響黑色素的生成5）保濕功效測試。健康的皮膚角質(zhì)層應(yīng)水分充足，皮膚水分充足可以增強皮膚彈性，減少皺紋生成和色素沉著。選好受試部位（所有志愿者受試部位相同）并做好標記。直接使用皮膚含水量測定儀測量標記區(qū)域的含水量，記錄數(shù)據(jù)。前3塊區(qū)域分別涂抹保濕水、護膚霜、面膜液[（2.0±0.1)mg/cm2結(jié)果與分析2.1最低抑制濃度的確定由表1可知，當稀釋倍數(shù)在8倍及以下時，均未長菌，說明稀釋8倍及以下時均有明顯的抑菌作用。故可確定地木耳乙醇提取物對E.coli的最低抑制濃度（MIC）為8倍，即藥物濃度為0.25g/mL。此結(jié)果為后續(xù)測定培養(yǎng)液電導(dǎo)率、總糖、可溶性蛋白質(zhì)提供了試驗基礎(chǔ)。2.2抑菌圈試驗測定地由表2可知，當?shù)啬径掖继崛∥锵♂?倍及以內(nèi)時均出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，且在稀釋倍數(shù)為2、4、8倍時，抑菌圈直徑呈直線下降，說明濾紙片中的抑菌物質(zhì)與稀釋濃度呈正相關(guān)。當稀釋倍數(shù)為16倍時，有2組試驗中未出現(xiàn)抑菌圈，表明在該稀釋倍數(shù)下濾紙片中的抑菌物質(zhì)的含量不足以抑制E.coli的生長和繁殖。此結(jié)果可與最低抑制濃度（MIC）的測定試驗相互印證。2.3地木耳乙醇提取物對e.coli表達的抑菌機理E.coli在接種2h后開始進入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期的E.coli菌體活性較高。較高的代謝水平有利于抑菌物質(zhì)及時作用于菌體，故選定在接種2h后向LB液體培養(yǎng)基中加入地木耳乙醇提取物，以測試各項指標，研究地木耳乙醇提取物對E.coli的抑菌機理。由圖1可知，當向菌懸液中加入地木耳乙醇提取物后（2h），試驗組E.coli繁殖基本停止，地木耳乙醇提取物加入2h內(nèi)有部分菌體死亡導(dǎo)致菌懸液濃度降低，即地木耳乙醇提取物可影響E.coli的正常生長。同時對照組E.coli生長狀態(tài)良好，繁殖速度快，進一步證明試驗組E.coli的生長停滯是由此試驗的惟一變量因素導(dǎo)致的。2.4地木耳乙醇提取物對e.coli液體培養(yǎng)基上清液電導(dǎo)率的影響細胞膜能維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。當細胞膜被破壞時，細胞質(zhì)中大量電解質(zhì)將進入到液體培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基的電導(dǎo)率上升。此時，可通過測定培養(yǎng)物上清液電導(dǎo)率來反映細菌細胞膜滲透性的變化情況由圖2可知，當向菌懸液中加入地木耳乙醇提取物后，LB液體培養(yǎng)基上清液電導(dǎo)率開始升高，且隨著地木耳乙醇提取物對E.coli作用時間的延長而持續(xù)升高，這說明加入地木耳乙醇提取物后E.coli細胞膜被破壞而發(fā)生胞質(zhì)滲漏，且發(fā)生胞質(zhì)滲漏的速度不斷加快。加入地木耳乙醇提取物4h后，試驗組上清液的電導(dǎo)率達到最大值，說明此時已經(jīng)導(dǎo)致大部分菌體細胞破損，地木耳乙醇提取物能在短時間內(nèi)破壞E.coli細胞壁，達到抑菌的目的。2.5地木耳乙醇提取物對e.coli液體培養(yǎng)基上清液可溶性總糖含量的影響E.coli會儲備糖類作為能源儲備物質(zhì)，當其膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞時，細胞內(nèi)的物質(zhì)（如糖類等）會進入培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中可溶性總糖濃度上升。可通過觀測培養(yǎng)物上清液中可溶性總糖濃度的變化，間接反映細菌膜結(jié)構(gòu)的完整性由圖3可知，在加入地木耳乙醇提取物之后，E.coli培養(yǎng)物上清液中的可溶性總糖濃度開始升高，說明加入地木耳乙醇提取物后部分細胞開始滲漏出糖類進入培養(yǎng)基。在加入地木耳乙醇提取物4h左右，E.coli培養(yǎng)物上清液中可溶性總糖濃度達到最大值，說明此時大部分E.coli細胞膜遭到破壞，菌體內(nèi)容物逐漸滲漏到胞外。同時對照組培養(yǎng)物中可溶性總糖濃度因E.coli的正常生長繁殖消耗而逐漸降低。此結(jié)果與上述試驗中電導(dǎo)率的結(jié)果一致。2.6地木耳乙醇提取物對coli培養(yǎng)物上清液蛋白質(zhì)含量的影響由圖4可知，在加入地木耳乙醇提取物后，E.coli培養(yǎng)物上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量開始顯著升高，說明加入地木耳乙醇提取物導(dǎo)致部分細胞的細胞膜遭到破壞從而使蛋白質(zhì)流出2.7地耳膏的性質(zhì)測試2.7.1感官和ph的測量通過對地木耳化妝品的感官測試和pH測定，發(fā)現(xiàn)制備的化妝品均符合國家化妝品標準，具體結(jié)果見表3。2.7.2穩(wěn)定性試驗的結(jié)果通過穩(wěn)定性測試，發(fā)現(xiàn)制備的化妝品的穩(wěn)定性均表現(xiàn)良好，在改變溫度以及離心的條件下，其性能均可保持穩(wěn)定（表4）。2.7.3地木耳化妝品的注意事項斑貼試驗結(jié)果表明，未出現(xiàn)紅斑、水腫、丘疹、水皰等不良反應(yīng)，也未出現(xiàn)過敏反應(yīng)。在使用地木耳化妝品時，覺得涂抹部位滋潤清涼舒適。由此可以初步判斷地木耳化妝品對人體皮膚沒有危害，無毒副作用。2.7.4氨酸酶的抑制作用1）美白功效。從測試結(jié)果來看，地木耳化妝品對酪氨酸酶活性均有一定抑制作用，其中地木耳濕紙巾型面膜對酪氨酸酶的抑制作用最好（圖5）。若長期使用此類護膚品可以達到一定的美白效果。2）保濕功效。由表5可知，每個地木耳化妝品涂敷的部分含水量遠高于空白對照部分，說明地木耳化妝品能有效補充皮膚流失的水分，保持肌膚彈性。涂敷1h后，試驗組皮膚含水量仍高于空白對照組，可使皮膚長期處于水分充足的狀態(tài)，預(yù)防皮膚皸裂。3地木耳化妝品功效成分地木耳乙醇提取物有良好的抑菌性，對E.coli的最低抑制濃度（MIC）為0.25g/mL。E.coli在經(jīng)過地木耳乙醇提取物處理后會發(fā)生胞質(zhì)滲漏，發(fā)揮作用速度較快，且隨著作用時間的延長胞質(zhì)滲漏現(xiàn)象越來越明顯，在加入地木耳乙醇提取物4h后大部分菌體細胞膜破損，能在短時間內(nèi)達到抑菌的目的。所制備的地木耳化妝品的感官評價和pH均符合國家化妝品標準，并在改變溫度和離心的情況下均表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定