PCR檢測(cè)技術(shù)的分析前質(zhì)量控制

臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

分析前質(zhì)量控制上海市臨床檢驗(yàn)中心徐翀全面質(zhì)量管理阿曼德·費(fèi)根堡姆（ArmandVallinFeigenbaum）——全面質(zhì)量控制之父、質(zhì)量大師、《全面質(zhì)量控制》的作者最早提出全面質(zhì)量管理概念，努力擯棄當(dāng)時(shí)最受關(guān)注的質(zhì)量控制的技術(shù)方法，而將質(zhì)量控制作為一種管理方法。臨床實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量管理2003年3月正式頒布《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力專用要求》（ISO/IEC15189），其核心就是加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的全面質(zhì)量管理。全面質(zhì)量管理就是按系統(tǒng)學(xué)的原理，建立一個(gè)體系，使在實(shí)驗(yàn)的全過(guò)程中所有影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的要求和環(huán)節(jié)都處于受控狀態(tài)，保證每個(gè)環(huán)節(jié)的協(xié)調(diào)和統(tǒng)一，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果始終可靠。全面質(zhì)量管理的劃分為了方便管理，ISO/IEC15189文件將實(shí)驗(yàn)過(guò)程各環(huán)節(jié)劃分為分析前質(zhì)量管理、分析中質(zhì)量管理和分析后質(zhì)量管理。分析前質(zhì)量管理的內(nèi)涵ISO/IEC15189對(duì)于分析前程序的明確定義：按照時(shí)間順序，從臨床醫(yī)生開(kāi)出醫(yī)囑開(kāi)始，到分析檢驗(yàn)程序時(shí)終止的步驟，包括檢驗(yàn)申請(qǐng)、患者的準(zhǔn)備、原始樣品的采集、運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳輸。這個(gè)過(guò)程大部分工作都是醫(yī)生、護(hù)士、護(hù)工等在實(shí)驗(yàn)室以外完成的。分析后質(zhì)量評(píng)估分析中質(zhì)量控制

患者準(zhǔn)備檢查患者申請(qǐng)檢驗(yàn)標(biāo)本采集標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本處理人員素質(zhì)工作環(huán)境實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)室管理儀器質(zhì)量保證方法選擇與評(píng)價(jià)試劑選擇與評(píng)價(jià)建立操作規(guī)程室內(nèi)質(zhì)控及分析標(biāo)本分析測(cè)定臨床醫(yī)師反饋信息室內(nèi)復(fù)查保留標(biāo)本隨時(shí)復(fù)查運(yùn)送報(bào)告患者投訴室間質(zhì)評(píng)登記填發(fā)報(bào)告分析前質(zhì)量保證分析中質(zhì)量控制分析前程序的特點(diǎn)分析前階段所占時(shí)間比例大。分析前程序的特點(diǎn)分析前質(zhì)量管理是最易出現(xiàn)問(wèn)題、涉及人員最多、潛在因素最多、最難控制的環(huán)節(jié)。發(fā)生在臨床實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤分析MarioPlebani.Errorsinclinicallaboratoriesorerrorsinlaboratorymedicine?ClinicalChemicalLaboratoryMedicine.2006,Volume44,Issue6,750–759發(fā)生在臨床實(shí)驗(yàn)室的錯(cuò)誤分析臨床反饋不滿意的檢驗(yàn)結(jié)果，80%的報(bào)告最終可溯源到標(biāo)本質(zhì)量不符合要求?！夺t(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號(hào)

第十五條醫(yī)療機(jī)構(gòu)和采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)有分析前質(zhì)量保證措施，應(yīng)制定患者準(zhǔn)備、標(biāo)本采集、標(biāo)本貯存、標(biāo)本運(yùn)送、標(biāo)本接收等標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，標(biāo)本采集和接收記錄完整，并由醫(yī)療機(jī)構(gòu)和采供血機(jī)構(gòu)組織實(shí)施。上海市臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)及相關(guān)分子診斷技術(shù)審核表做好分析前質(zhì)量管理要點(diǎn)建立實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理文件加強(qiáng)與醫(yī)生、護(hù)士、受檢者和實(shí)驗(yàn)室人員的溝通與培訓(xùn)通過(guò)Lis-His網(wǎng)絡(luò)化管理臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理軟件：檢測(cè)人員：應(yīng)當(dāng)經(jīng)省級(jí)以上衛(wèi)生行政部門指定機(jī)構(gòu)技術(shù)培訓(xùn)合格后，方可從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作。臨床醫(yī)生、護(hù)士、護(hù)工及標(biāo)本接收人員等需溝通與培訓(xùn)。臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理硬件

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)

2.標(biāo)本制備區(qū)

3.擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分析前質(zhì)量管理質(zhì)量手冊(cè)

程序性文件

質(zhì)量記錄（表格、記錄本等）

作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程）

文件第三層次：具體工作人員使用更詳細(xì)文件

第四層次：用于質(zhì)量體系運(yùn)行的證實(shí)依質(zhì)量體系文件層次圖綱領(lǐng)文件支持文件

證實(shí)監(jiān)督文

分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件——臨床標(biāo)本的采集、運(yùn)送、接收和保存

每類標(biāo)本或每個(gè)項(xiàng)目的特定標(biāo)本如：血清、血漿、分泌物、尿液、痰、腦脊液、胸腹水及組織等，都應(yīng)有一個(gè)采集、運(yùn)送、接收和保存的SOP。分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件編寫目的：

通過(guò)規(guī)范相應(yīng)臨床標(biāo)本的采集方法、所用容器、運(yùn)送方式、保存條件及接收，確保所采集的標(biāo)本在檢測(cè)前的有效性。分析前質(zhì)量管理相關(guān)SOP文件基本內(nèi)容：特定標(biāo)本采集的具體方法和步驟明確規(guī)定標(biāo)本的采集容器要求明確標(biāo)本的采集量明確標(biāo)本采集后送到實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所能允許的最大時(shí)間間隔明確標(biāo)本采集后，在送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)前的保存方式和條件明確標(biāo)本從采集處運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室過(guò)程中所要求的運(yùn)送條件明確標(biāo)本接收時(shí)，簽收的程序、拒收的標(biāo)準(zhǔn)和標(biāo)本惟一編號(hào)的規(guī)則規(guī)定標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的短期和長(zhǎng)期保存條件和要求制定保證標(biāo)本安全，即如何防止標(biāo)本丟失、調(diào)換、變質(zhì)的措施分析前質(zhì)量管理的核心問(wèn)題醫(yī)囑（責(zé)任人——醫(yī)生）標(biāo)本采集（責(zé)任人——醫(yī)生、護(hù)士）標(biāo)本運(yùn)送與保存（責(zé)任人——護(hù)工）標(biāo)本驗(yàn)收與保存（責(zé)任人——檢驗(yàn)人員）檢驗(yàn)申請(qǐng)表信息充分患者的唯一標(biāo)識(shí)醫(yī)生的姓名或唯一標(biāo)識(shí)，最終檢驗(yàn)報(bào)告目的地原始樣品的類型申請(qǐng)的檢驗(yàn)項(xiàng)目患者的相關(guān)臨床資料，至少包括性別和出生日期原始樣品采集日期和時(shí)間實(shí)驗(yàn)室收到樣品的日期和時(shí)間標(biāo)本的采集標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響

病原體感染機(jī)體后，特定的臨床標(biāo)本中，病原體含量能達(dá)到PCR檢出水平的時(shí)間點(diǎn)，并不能覆蓋整個(gè)感染過(guò)程，可能只是在感染或疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的某一個(gè)時(shí)間段。

如HBV何HCV感染后，在特異抗原和抗體出現(xiàn)以前，血循環(huán)中即可有較高濃度病原體存在，而當(dāng)抗體出現(xiàn)后，病原體的濃度可能會(huì)低于PCR或RT-PCR方法的測(cè)定下限。標(biāo)本的采集標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響采集血液標(biāo)本需空腹，脂血干擾核酸測(cè)定采集肺結(jié)核患者標(biāo)本，晨起后生理鹽水反復(fù)漱口后用力深咳標(biāo)本的采集標(biāo)本的采集類型血液標(biāo)本：用于HBV、HCV檢測(cè)。研究表明對(duì)于病原體RNA測(cè)定，最好使用EDTA抗凝全血標(biāo)本（嚴(yán)禁使用肝素），抗凝后6h內(nèi)分離血漿。如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2h內(nèi)）分離血清。痰液：結(jié)合分枝桿菌病檢測(cè)。各種分泌物：泌尿生殖道拭子用于衣原體檢測(cè)。尿液、腦脊液、漿膜腔液、胸腹水和組織等。PCR標(biāo)本應(yīng)獨(dú)立收集，密閉運(yùn)輸，不能使用從其他檢測(cè)如生化、免疫、血液學(xué)檢測(cè)分出的標(biāo)本。肝素對(duì)PCR檢測(cè)的影響肝素使DNA抽提得率降低肝素能結(jié)合并激活全血中多種蛋白酶原和補(bǔ)體系統(tǒng)，由此引起的一系列反應(yīng)使DNA在提取過(guò)程中不斷降解。肝素在DNA提取過(guò)程中難以去除肝素為含多量硫酸基團(tuán)的粘多糖硫酸酯，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。理化性質(zhì)決定了在DNA抽提過(guò)程中，不能被酚、氯仿去除，也不能被乙醇沉淀、洗滌去除。肝素對(duì)PCR檢測(cè)的影響肝素使PCR擴(kuò)增效率降低肝素對(duì)DNA聚合酶具有強(qiáng)大的親和力，使后者不能與Mg2+作用形成正確的親引物-模板符合體的活性中心。肝素帶有強(qiáng)大負(fù)電荷，與DNA聚合酶結(jié)合后與同樣帶有較高負(fù)電荷的模板DNA之間產(chǎn)生排斥作用。肝素?cái)y帶的強(qiáng)大負(fù)電荷中和反應(yīng)體系中的陽(yáng)離子如Mg2+和K+，使作為DNA聚合酶輔助因子的Mg2+濃度下降。使用一次性無(wú)菌及無(wú)核酸酶的材料綠頭管為含肝素類抗凝劑標(biāo)本的采集標(biāo)本采集過(guò)程泌尿生殖道分泌物采集消毒：采集部位如為泌尿生殖道，過(guò)度消毒可能會(huì)去掉或破壞靶微生物。采集：將拭子深入至尿道口2至3厘米處用力旋轉(zhuǎn)1至2圈。痰液采集患者漱口，用力咳出氣管深出第一口痰于清潔干燥無(wú)菌的容器內(nèi)。對(duì)于無(wú)痰或少痰的患者，可用45加溫的100g/LNaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出。對(duì)于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導(dǎo)咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標(biāo)本標(biāo)本的運(yùn)送與保存標(biāo)本采集后，應(yīng)盡快送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。采集后的所有樣本在送至實(shí)驗(yàn)室之前，均應(yīng)暫放在2~8℃臨時(shí)保存。靶核酸為DNA的標(biāo)本，如為無(wú)菌條件下采集，可在室溫下8小時(shí)內(nèi)運(yùn)送。靶核酸為RNA的標(biāo)本，短時(shí)間內(nèi)的運(yùn)送（如10min左右），可在室溫下運(yùn)送；如時(shí)間較長(zhǎng)，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送。如在標(biāo)本中加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑（如GITC）的血標(biāo)本，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。靶核酸為RNA的標(biāo)本，采集后建議在4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本運(yùn)送過(guò)程中應(yīng)充分考慮生物安全問(wèn)題。有合適的容器轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本，帶蓋的透明轉(zhuǎn)運(yùn)盒，有生物危害標(biāo)識(shí)。標(biāo)本的驗(yàn)收標(biāo)本接收的地點(diǎn)不宜放在在標(biāo)本制備區(qū)，減少實(shí)驗(yàn)室污染的機(jī)會(huì)。可在四區(qū)外單獨(dú)設(shè)置或與其他臨床標(biāo)本接收處放在一起。標(biāo)本的驗(yàn)收采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)血清（漿）標(biāo)本：體積不少于2ml。觀察是否溶血、脂血、黃疸及其程度。嚴(yán)重溶血：血紅蛋白及其代謝產(chǎn)物可能抑制Taq酶活性，使PCR擴(kuò)增效率明顯降低。嚴(yán)重黃疸：膽紅素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白對(duì)熒光有屏蔽和吸收作用，故對(duì)RealTimePCR有干擾。標(biāo)本的驗(yàn)收采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)2.分泌物標(biāo)本：從細(xì)胞組成、所需類型細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行評(píng)價(jià)

泌尿生殖道分泌物標(biāo)本可以顯微鏡下觀察是否有上皮細(xì)胞存在3.痰液標(biāo)本：體積不少于5ml。外觀規(guī)定膿樣、血性、干酪樣及膿性粘液樣痰為合格。鏡下用油鏡觀察白細(xì)胞大于10個(gè)。標(biāo)本的驗(yàn)收核對(duì)標(biāo)本的采集時(shí)間，嚴(yán)格控制標(biāo)本運(yùn)送時(shí)間靶核酸為DNA的標(biāo)本，如為無(wú)菌條件下采集，可在室溫下8小時(shí)內(nèi)送達(dá)。靶核酸為RNA的標(biāo)本，采集后4h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，并注意運(yùn)送條件。標(biāo)本的驗(yàn)收標(biāo)本的唯一性編號(hào)編號(hào)時(shí)，建議體現(xiàn)出項(xiàng)目的區(qū)別，比如：2012年3月19日，第一個(gè)送達(dá)的HBV-DNA標(biāo)本，可編號(hào)成B12031901可用字母C用于HCV-RNA，T用于TB-DNA，P用于HPV-DNA的編號(hào)交接填表、簽名，拒收填表、簽名臨床PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收記錄以上標(biāo)本編號(hào)從

至

，送檢人（簽字）：

接收人（簽字）：