培養(yǎng)基質(zhì)量控制

物理性狀的質(zhì)量控制應(yīng)包括20°C-25°C時(shí)的pH,并應(yīng)觀察以下內(nèi)容：加入培養(yǎng)基的量和(或)瓊脂層的厚度、顏色、透明度、是否存在肉眼可見的雜質(zhì)、凝膠穩(wěn)定性/黏稠度(一致性)、濕度。滅菌前后都應(yīng)測定pH,采用連接可滲透陶器型液體接頭的電極測定液體培養(yǎng)基的pH，固體培養(yǎng)基可用平頭電極或者連接微型探頭的電極測定pH,測量時(shí)盡量使培養(yǎng)基溫度降到20C-25C，校正通常用接近40g/L的氫氧化鈉或者1mol/L的鹽酸。微生物的質(zhì)量控制污染檢測在每批制備好的培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)選取部分樣品進(jìn)行污染測試。質(zhì)控菌株質(zhì)控菌種應(yīng)具有穩(wěn)定特性，能代表其種并能有效地證明實(shí)驗(yàn)室特定培養(yǎng)基的最佳性能。測試菌種應(yīng)可溯源至國家或國際公認(rèn)的菌種收藏中心，也可以是實(shí)驗(yàn)室自己分離的具有良好特性的菌種，但必須對照標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)檢測和記錄儲存菌株(stockculture)的相關(guān)特性，新復(fù)蘇的菌種可能會有非特異性反應(yīng)。最好使用從食品中分離的菌種。培養(yǎng)基的質(zhì)控菌種應(yīng)具備以下性能：具典型反應(yīng)的強(qiáng)陽性菌種；弱生長的陽性菌種(選擇更敏感的菌種);無生化反應(yīng)的菌種；完全抑制菌種。質(zhì)控方法國際食品微生物委員會和培養(yǎng)基菌種衛(wèi)生工作組(WPCM)介紹了培養(yǎng)基評估用測試菌種的有效收集方法。即用培養(yǎng)基和試劑商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠家如果經(jīng)過IS09001和ISO9002體系認(rèn)證或滿足相應(yīng)質(zhì)量要求，應(yīng)向使用方提供資質(zhì)證明。這時(shí)，使用者就不必對培養(yǎng)基進(jìn)行大量的測試工作，但必須保證其儲存條件。采用商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基按ISO/TS11133-1:2009《食品和動物飼料的微生物學(xué)培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則》的要求，除了對每批制備好的培養(yǎng)基用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測試外，還應(yīng)用實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，以更好地保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。對于不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，只需用陽性測試菌種進(jìn)行測試。對于含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，必須使用能證明其指示或選擇作用的菌種進(jìn)行試驗(yàn)。對于復(fù)合培養(yǎng)基，即需要加入添加成分的培養(yǎng)基，要用具備上述性能的菌種逐批進(jìn)行檢驗(yàn)。對實(shí)驗(yàn)室制備的需加入添加成分的制成培養(yǎng)基同樣適用。按照培養(yǎng)基配方制備的培養(yǎng)基建議除了按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)基品質(zhì)測試外，還要用改良的Miles-Misra技術(shù)、螺旋平板技術(shù)或菌落總數(shù)技術(shù)進(jìn)行測試，以監(jiān)控基礎(chǔ)材料的質(zhì)量、培養(yǎng)基性能和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的配制規(guī)范。實(shí)際上，食品中包含有應(yīng)激反應(yīng)的微生物，還應(yīng)考慮到培養(yǎng)基在應(yīng)激細(xì)菌恢復(fù)方面的適用性。培養(yǎng)基性能測試方法實(shí)驗(yàn)室可采用半定量和定量技術(shù)對固體、液體培養(yǎng)基的性能進(jìn)行測試，在多數(shù)情況下能滿足對培養(yǎng)基性能測試的要求。對于特殊情況，如評價(jià)一種新的培養(yǎng)基或一個(gè)新的生產(chǎn)商的產(chǎn)品等，應(yīng)采用定量測試法。固體培養(yǎng)基應(yīng)用于固體培養(yǎng)基質(zhì)控程序的技術(shù)大都依靠菌落計(jì)數(shù)。主要應(yīng)用的技術(shù)有：傾注法、涂布法、旋轉(zhuǎn)涂布法、改良的Miles-Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。這些方法作為食品實(shí)驗(yàn)室的日常方法得到了國際公認(rèn)。由于傾注法、涂布法及螺旋涂布法在日常工作中經(jīng)常使用，這里不再介紹，著重介紹一下改良的Miles-Misra方法、半定量劃線法和定性劃線法。⑴改良的Miles-Misra方法改良的Miles-Misra方法是通過測試培養(yǎng)基的生長率(productivityratio,PR)來檢查培養(yǎng)基的性能，通常與對照培養(yǎng)基相比。對照培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)是富含營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如：胰酪月東大豆瓊脂。該方法步驟如下：將試驗(yàn)菌株的過夜培養(yǎng)物用緩沖蛋白東水10倍梯度稀釋。將試驗(yàn)和對照培養(yǎng)基做成4mm厚的平板，并使平板表面干燥。從最高稀釋度(如10-5)開始，分別滴1滴稀釋液于試驗(yàn)平板和對照平板標(biāo)記好的區(qū)域。每個(gè)稀釋度各取4滴分別加入4個(gè)試驗(yàn)和對照培養(yǎng)基，每1滴的涂布超過四分之一平板，并用涂布器從高稀釋度開始涂布，37°C培養(yǎng)18h。對數(shù)量和菌落形態(tài)進(jìn)行評價(jià)。評價(jià)方法，即按下列方式計(jì)算：PR=Ns/No式中：PR--生長率；Ns-試驗(yàn)培養(yǎng)基的菌落數(shù)；No-對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)。示例：在10-3稀釋度，試驗(yàn)培養(yǎng)基上為20個(gè)菌落，對照培養(yǎng)基上為25個(gè)菌落，則PR=0.80。(2)半定量劃線法使用本方法時(shí)，所有測試培養(yǎng)基應(yīng)干燥到相同程度，且整個(gè)步驟應(yīng)標(biāo)注化，以便于比較同批次培養(yǎng)基的測試結(jié)果。用1uL接種環(huán)劃線平板。在A區(qū)用接種環(huán)按0.5cm的間隔劃4條平行線，按同樣的方法：B區(qū)和C區(qū)劃線，最后在D區(qū)內(nèi)劃一條線。按標(biāo)準(zhǔn)方法所規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。通常情況下用同一接種環(huán)對A區(qū)?D區(qū)進(jìn)行劃線，在不同區(qū)域劃線時(shí)不需對接種環(huán)滅菌。但為了得到低生長指數(shù)G1,在A區(qū)和B區(qū)接種應(yīng)更換接種環(huán)或?qū)ζ溥M(jìn)行滅菌。評價(jià)方法：培養(yǎng)后，評估菌落的形狀、大小和密度，并計(jì)算生長指數(shù)G1。每條有菌落生長的劃線記作1分，每個(gè)培養(yǎng)皿上最多為16分。如果僅一半的線有菌落生長，記作0.5分。如果劃線上沒有菌落生長或生長量少于劃線一半，則記作0分。記錄每個(gè)平板的得分總和便得到G1。例如：菌落在A區(qū)和B區(qū)全部生長，而在C區(qū)有一半線生長，則G1為10。目標(biāo)菌的生長指數(shù)G1大于6時(shí)，則判定培養(yǎng)基可接受。非選擇性培養(yǎng)基的G1值通常更高。目標(biāo)菌應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長，而非目標(biāo)菌的生長應(yīng)部分或完全被抑制。⑶定性劃線法該方法只是定性測試，劃線培養(yǎng)后，按照要求進(jìn)行打分，得分是指示性的，可用作固體培養(yǎng)基性能測試的補(bǔ)充。取1uL測試菌株培養(yǎng)物在測試培養(yǎng)基表面劃平行直線，可同時(shí)在一個(gè)平板上接種多個(gè)菌株，但劃線不能交叉，然后按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。評價(jià)方法：培養(yǎng)后按以下方法進(jìn)行平板生長評估：0表示無生長，1表示生長，2表示良好生長。目標(biāo)菌得分應(yīng)為2,并且有典型的菌落外觀、大小和形態(tài)。非目標(biāo)菌的生長應(yīng)該部分或全部被抑制。液體培養(yǎng)基為確定液體培養(yǎng)基的生長率，應(yīng)接種適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物。下面介紹的是用定量、半定量和定性方法評估生長率和選擇性的方法。所推薦的這些方法都是通過將液體培養(yǎng)基以傾注或劃線方式接種到瓊脂平板上培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)或計(jì)算液體培養(yǎng)基分?jǐn)?shù)而得出其生長數(shù)量的。對于液體培養(yǎng)基定性測試方法，則通過肉眼觀察來實(shí)現(xiàn)。目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的定量稀釋法步驟如下：選擇液體培養(yǎng)基10mL/管待檢。接種目標(biāo)菌：將少量測試菌株培養(yǎng)物（每管10CFU-100CFU）接種測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。接種非目標(biāo)菌：將大量測試菌株培養(yǎng)物(每管大于1000CFU)接種測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯，混勻。接種目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合培養(yǎng)物：用少量目標(biāo)菌(每管10CFU-100CFU)測試肉湯和標(biāo)準(zhǔn)肉湯。同時(shí)每管接種大量非目標(biāo)菌(每管大于1000CFU)，混勻。稀釋劑和運(yùn)輸培養(yǎng)基中目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的接種：接種測試菌于稀釋劑中(每管100CFU?1000CFU),混勻。按標(biāo)準(zhǔn)方法中的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果的計(jì)算和解釋：計(jì)算目標(biāo)和非目標(biāo)微生物的菌落數(shù)，用生長率(PR)和選擇因子(SF)進(jìn)行結(jié)果的解釋。目標(biāo)微生物的PR不應(yīng)小于0.1(因生長的不同不能超過1個(gè)數(shù)值).非目標(biāo)微生物的SF至少應(yīng)達(dá)到2。SF的計(jì)算見式：SF=Do-Ds式中：Do-在參考培養(yǎng)基上能生長至少10個(gè)菌落的最高稀釋度；Ds-在測試培養(yǎng)基上顯示相應(yīng)生長的最高稀釋度；SF、Do和Ds用Ig表示。例如：Do=lg104=4.0,Ds=lg103=3.0,選擇因子SF=1.0?；旌暇曛校繕?biāo)菌的生長不應(yīng)受到非目標(biāo)菌的抑制，即目標(biāo)菌始終應(yīng)為優(yōu)勢菌群。在混合菌株中目標(biāo)菌數(shù)量的最低值及非目標(biāo)菌數(shù)量的最高值應(yīng)符合以下要求:目標(biāo)菌的最低濃度應(yīng)