第14章 臨床免疫檢驗(yàn)的自動(dòng)化分析

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第十四章臨床免疫檢驗(yàn)的自動(dòng)化分析陶志華目錄第一節(jié)免疫濁度測定的自動(dòng)化分析一、免疫散射比濁測定的自動(dòng)化分析二、免疫散射比濁測定的影響因素第二節(jié)發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光測定的自動(dòng)化分析二、酶聯(lián)發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析四、發(fā)光氧通道免疫測定的自動(dòng)化分析目錄第三節(jié)熒光免疫測定的自動(dòng)化分析一、時(shí)間分辨熒光免疫測定的自動(dòng)化分析二、熒光偏振免疫測定的自動(dòng)化分析第四節(jié)酶聯(lián)免疫測定的自動(dòng)化分析第五節(jié)臨床免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化分析的選擇與應(yīng)用一、臨床免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化分析的選擇原則二、臨床免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化分析的臨床應(yīng)用重點(diǎn)提示臨床免疫檢驗(yàn)的自動(dòng)化分析(automationofimmunoassays)是將免疫學(xué)檢驗(yàn)過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號(hào)檢測、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果報(bào)告和檢測后的儀器清洗等步驟由計(jì)算機(jī)控制，儀器自動(dòng)完成整個(gè)免疫檢驗(yàn)過程。重點(diǎn)提示各種自動(dòng)化免疫分析儀都使用一種或兩種免疫分析技術(shù)，如酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、生物素-親合素技術(shù)、化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)、熒光偏振免疫測定技術(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫測定技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)等。有些免疫檢驗(yàn)如免疫透射比濁則可采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測，有些則整合在其它一些自動(dòng)化分析系統(tǒng)中，如自動(dòng)化血凝分析儀。重點(diǎn)提示通過本章學(xué)習(xí)，學(xué)生將全面掌握臨床上常用的全自動(dòng)免疫分析儀的類型、儀器檢測技術(shù)要點(diǎn)和影響因素。通過本章學(xué)習(xí)，學(xué)生還將了解臨床實(shí)驗(yàn)室選擇選擇原則和臨床應(yīng)用。第一節(jié)免疫濁度測定的自動(dòng)化分析免疫濁度分析的基本原理抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復(fù)合物（<19S），在增濁劑（如PEG等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（>19S），使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4免疫散射比濁儀粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長和強(qiáng)度、測量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：式Iθ中為與入射光成θ角處散射光強(qiáng)度；λ和I0為入射光的波長和強(qiáng)度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數(shù)和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數(shù)；γ為顆粒到檢測器的距離；θ為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。定時(shí)散射比濁法（fixedtimenephelometry）

檢測原理：定時(shí)散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時(shí)反應(yīng)立即開始，在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。定時(shí)散射比濁法是避開抗原抗體反應(yīng)的不穩(wěn)定階段，即散射光信號(hào)在開始反應(yīng)7.5s～2min內(nèi)的第一次讀數(shù)，專門在抗原抗體反應(yīng)的最佳時(shí)段進(jìn)行讀數(shù)，將檢測誤差降到最低。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)：1.抗原抗體預(yù)反應(yīng)階段2.反應(yīng)階段3.信號(hào)檢測4.抗原過剩檢測(1)抗體適當(dāng)過量(2)對抗原過量進(jìn)行閾值限定定時(shí)散射比濁法（fixedtimenephelometry）

速率散射比濁法（ratenephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)測定法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量（不是免疫復(fù)合物累積的量），連續(xù)測定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起，形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法，每項(xiàng)檢測僅1min～2min即可完成?？乖贵w反應(yīng)速率的動(dòng)態(tài)變化儀器測定技術(shù)要點(diǎn)：開啟機(jī)器，進(jìn)行校準(zhǔn)反應(yīng)階段抗原過量檢測速率散射比濁法（ratenephelometry）BNProSpec全自動(dòng)特定蛋白分析儀IMMAGE全自動(dòng)特定蛋白分析儀免疫散射比濁儀方法評價(jià)散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動(dòng)化程度高，具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴,對抗體的質(zhì)量要求很高。免疫比濁分析的影響因素1.抗原抗體比例2.抗體的質(zhì)量3.增濁劑的使用4.偽濁度5.入射光光源和波長6.校準(zhǔn)曲線制備與質(zhì)量控制第二節(jié)發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析發(fā)光免疫測定的自動(dòng)化分析是通過抗原或抗體標(biāo)記技術(shù)、抗原或抗體的抗原抗體反應(yīng)、固相分離技術(shù)、發(fā)光技術(shù)和計(jì)算機(jī)信息技術(shù)進(jìn)行有機(jī)整合，實(shí)現(xiàn)了加樣、溫育、固相載體分離清洗、發(fā)光信號(hào)檢測和數(shù)據(jù)處理等過程自動(dòng)化。一、吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以吖啶酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結(jié)合法等相同。

磁微粒分離技術(shù)YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY順磁性微粒示意圖

磁微粒技術(shù)

磁微粒在電磁場中分離磁微粒標(biāo)記抗體發(fā)光YYY磁微粒被測抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后雙抗體夾心法（1）加入酸性H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）儀器測定技術(shù)要點(diǎn)吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ACS：180SEACS∶CENTAURci8200i2000sr酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光或熒光反應(yīng)的酶來標(biāo)記抗原或抗體，在抗原抗體反應(yīng)后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號(hào)的強(qiáng)弱來進(jìn)行被測物的定量。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時(shí)間延長。魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產(chǎn)生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時(shí)，發(fā)出微綠色可見光。魯米諾增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的原理儀器測定技術(shù)要點(diǎn)全自動(dòng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀

該儀器是以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行測定的自動(dòng)化儀器。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)Access全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀UniCel?DxI800全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀IMMULITE2000型全自動(dòng)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀該儀器以堿性磷酸酶標(biāo)記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團(tuán)，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)AXSYM全自動(dòng)酶標(biāo)記熒光免疫分析儀堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是采用電化學(xué)發(fā)光技術(shù)，生物素放大技術(shù)，以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設(shè)計(jì)的一種自動(dòng)化分析儀器。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長，易于控制并可根據(jù)待測分子的大小設(shè)計(jì)成多種反應(yīng)模式如夾心法、競爭法等。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)抗原抗體結(jié)合電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)光信號(hào)檢測檢測完畢全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀ModularAnalyticsE模塊170型發(fā)光氧通道免疫分析儀是一種整合了高分子納米微粒、免疫化學(xué)、CPM單光子計(jì)數(shù)技術(shù)的新型的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，所采用的均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)具有快速、均相（免沖洗）、高靈敏和操作簡單的特點(diǎn)。發(fā)光氧通道免疫分析儀以雙抗體夾心法為例1.抗原抗體結(jié)合將抗體包被感光微粒、抗體包被發(fā)光微粒和待測標(biāo)本加入反應(yīng)杯中，經(jīng)溫育后，形成抗體包被感光微粒-抗原-抗體包被發(fā)光微粒復(fù)合物。2.信號(hào)檢測用光子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)得到相對光量子單位(RLU)值，光的強(qiáng)度與待測抗原的濃度成正比，通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算抗原濃度。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)第三節(jié)熒光免疫測定的自動(dòng)化分析自動(dòng)化熒光免疫分析儀主要是將抗原—抗體結(jié)合反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析和計(jì)算機(jī)技術(shù)有機(jī)結(jié)合的一項(xiàng)自動(dòng)化免疫分析儀器。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要進(jìn)行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時(shí)間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。

時(shí)間分辨熒光免疫分析儀是采用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物，并與時(shí)間分辨測定技術(shù)相結(jié)合，而建立起來的一種熒光免疫分析儀器，所采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高，鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，校準(zhǔn)曲線范圍寬等特點(diǎn)。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)⒈抗原抗體結(jié)合⒉加入Eu3+螯合抗體⒊加入酸性增強(qiáng)液4.信號(hào)檢測時(shí)間分辨熒光免疫分析儀autoDELFIA全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)熒光偏振免疫分析儀是采用均相熒光免疫測定原理設(shè)計(jì)的一臺(tái)熒光免疫分析儀。該儀器利用熒光物質(zhì)在溶液中被單一平面的偏振光（波長485nm）照射后，可吸收光能而產(chǎn)生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光（波長525nm）。該熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)記物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小呈反比。常采用抗原抗體競爭反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。儀器測定技術(shù)要點(diǎn)1.抗原抗體反應(yīng)2.偏振熒光強(qiáng)度測定注意事項(xiàng)1.FPIA的結(jié)果好壞取決于熒光素標(biāo)記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復(fù)合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，除去干擾成分。第四節(jié)酶聯(lián)免疫測定的自動(dòng)化分析酶聯(lián)免疫測定的自動(dòng)化分析酶聯(lián)免疫測定的自動(dòng)化分析是將酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）各種操作步驟（加樣