熱休克蛋白與疾病

HeatShockProteinsandDiseasesDept.ofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CSUKangkaiWang09-026-2012CHANGSHAContentsI.IntroductionofHSPs

1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

VII.Perspectiveontranslationmedicine

1、對(duì)環(huán)境變化做出反應(yīng)是生物細(xì)胞的基本特征及生存的必要條件。2、生物細(xì)胞在高溫環(huán)境下所表現(xiàn)的以基因表達(dá)變化為特征的反應(yīng)稱熱休克反應(yīng)（heatshockresponse,HSR），所產(chǎn)生的一組蛋白質(zhì)叫熱休克蛋白（heatshockprotein,HSP）。3、除了熱休克外，許多其它理化及生物刺激都可誘導(dǎo)HSP的產(chǎn)生，故HSP又稱為應(yīng)激蛋白（stressprotein,SP）。

一、基本概念Ritossa’spuffs,19621、廣泛存在2、結(jié)構(gòu)保守3、在細(xì)胞正常生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用4、應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)增多，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用

二、HSP的特點(diǎn)

三、HSP的分類及細(xì)胞內(nèi)分布

主要HSP家族成員

分子量細(xì)胞內(nèi)定位可能的生物學(xué)功能HSP110亞家族～110000

HSP110

核仁,胞漿熱耐受,交叉耐受HSP105

胞漿蛋白質(zhì)折疊HSP90亞家族～90000

HSP90α(HSP86)

胞漿與類固醇激素受體結(jié)合,熱耐受HSP90β(HSP84)

胞漿與類固醇激素受體結(jié)合,熱耐受Grp94

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌蛋白質(zhì)的折疊HSP70亞家族～70000

HSC70(組成型)

胞漿蛋白質(zhì)折疊及移位HSP70(誘導(dǎo)型)

胞漿,核蛋白質(zhì)折疊,細(xì)胞保護(hù)作用HSP75

線粒體蛋白質(zhì)折疊及移位GRP78(Bip)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)新生蛋白質(zhì)折疊HSP60亞家族～60000

HSP60

線粒體蛋白質(zhì)的折疊TriC

胞漿蛋白質(zhì)的折疊

HSP47～47000

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膠原合成的質(zhì)量控制HSP40(hdj-1)

胞漿蛋白質(zhì)折疊小分子HSP亞家族20000～30000

HSP32(HO-1)

胞漿HSP27

胞漿,核肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)變化

αB-晶狀體蛋白

胞漿細(xì)胞骨架的穩(wěn)定HSP10～10000線粒體為HSP60的輔因子

泛素(ubiquitin)～8000胞漿,核蛋白質(zhì)的非溶酶體降解四、HSP的功能—分子伴侶（molecularchaperone）

1、幫助新合成蛋白質(zhì)的折疊，防止其互相聚集2、幫助蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)移位3、幫助變性蛋白質(zhì)的復(fù)性4、清除嚴(yán)重受損的蛋白質(zhì)SubstrateloadingcomplexfortheHSP90system[HSP90(orange),HSP70(lightorange),HSP40(yellow),HOP(blue),andclientsubstrate(red)

泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin-proteasomepathway）

泛素為分子量～8kd的HSP，促進(jìn)異常蛋白質(zhì)在蛋白酶體中降解。包括：不完全的蛋白質(zhì)，誤折疊的蛋白質(zhì)（由于基因突變等），變性的蛋白質(zhì)，多亞基復(fù)合物的游離亞基，不能結(jié)合輔因子的蛋白質(zhì)，氧化損傷的蛋白質(zhì)，不能在ER中折疊的膜蛋白或分泌蛋白，錯(cuò)誤導(dǎo)向的蛋白質(zhì)。

正常蛋白質(zhì)氧化應(yīng)激羰基化蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)混合二硫化物(PrSSG)

變性蛋白質(zhì)

泛素化堆積、聚集

蛋白酶體多肽碎片，氨基酸細(xì)胞凋亡五、HSP表達(dá)的調(diào)控

1、組成型表達(dá)(constitutiveexpression):涉及HSP基因5’端調(diào)控區(qū)的普通啟動(dòng)子及組織特異性啟動(dòng)子等，其調(diào)控機(jī)制至今仍不十分清楚。2、誘導(dǎo)表達(dá)(inducibleexpression):主要通過熱休克因子（HSF）調(diào)控。

一）、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控3、HSF家族

酵母——HSF（為存活所必須）果蠅——HSF（與存活及生長(zhǎng)無關(guān)，但為卵細(xì)胞發(fā)生及幼蟲發(fā)育所必須）雞——HSF1~3

小鼠——HSF1～2,HSF4

人——HSF1～2，HSF4

脊椎動(dòng)物HSF家族的主要功能

HSF1——調(diào)控HSR，受精卵早期發(fā)育、胎盤發(fā)育等

HSF2——胚胎發(fā)育?HSF3——僅在禽類發(fā)現(xiàn)，與HSF1有協(xié)同作用

HSF4——(4a,4b)功能不明，與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)Growthretrdation;FemaleinfertilityHSF1-/-二）、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控1、mRNA穩(wěn)定性Protein-RNAinteraction:nucleolinRNAbindingelement:(T/G)CCCG(A/G)withinthe5’or3’

UTRortheORFregionofthetargetgenes.AA1-309AA310-713MethodsforDetectingtheexpressionoftargetgenesandtheinteractionbetweennucleolinandmRNA:AfterinhibitionoftranscriptionwithactinomycinDWesternblotRT-PCRORrealtimePCRInteractionassayRNA-EMSARNA-IPandRT-PCRReportergeneanalysisSanguptaTK:JBC,2004,

279(12):10855-63RNA-EMSARNA-IPandIBCancio-LonchesC:JVirol.2011;85(16):8056–8068.GenesC23-bindingsequenceSitesHsp70(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRBcl-2(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRHsp32(HOX1)(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及3'－UTRHsf1GCCCGG編碼區(qū)Bmp4(U/G)CCCG(A/G)3'－UTRHSP90(U/G)CCCG(A/G)5’－UTR及編碼區(qū)COX-2GCCCGG編碼區(qū)及3'－UTRNAIP/BIRC1GCCCGG3'－UTRMCL1GCCCGG/GCCCGA編碼區(qū)BioinformaticsanalysisforthegenescontainingthenucleolinbindingmotifwithinthemRNAmoleculesNucleolin與HSP70

mRNA

3’-UTR直接結(jié)合，增加其穩(wěn)定性RNA-RNAinteraction:microRNA2、mRNA翻譯受抑microRNA完全互補(bǔ)

植物miRNA部分哺乳類miRNA

不完全互補(bǔ)

哺乳類miRNA

Western

Blot，RT-PCRWestern

BlotmicroRNA

increasesexpressionoftargetgenesChangY,CirculationRes.2009,104(5):572-5.3、翻譯后修飾磷酸化泛素化Ischemia30’/Reperfusion24hareaatrisk(AAR);

infarct-to-riskregionratioQianJ.CircRes.2009;105(12):1223-31nucleolinmicroRNAExpressionofHSPsmRNAstabilityTranslationrepressiontranscriptionPhosphorylationUbiquitinationHSFmRNAstabilityProteinstabilityandactivationstatusSummaryonregulationofHSPsexpressionContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與心臟疾病細(xì)胞保護(hù)心肌保護(hù)：外源性保護(hù)內(nèi)源性保護(hù)：缺血預(yù)適應(yīng)熱休克蛋白心肌內(nèi)源性保護(hù)概念的提出：

1986，Murry發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)（ischemicpreconditioning）；

1988，Currie發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱休克預(yù)處理后，大鼠心肌缺血-再灌注損傷減輕。

改變HSP70水平的方法心肌損傷模型保護(hù)作用參考文獻(xiàn)熱休克大鼠離體心I/R超微結(jié)構(gòu),心功能,酶釋放CurrieRW,1988心肌缺血,熱休克大鼠在體心I/R心肌力學(xué),梗塞面積DonnellyTJ,1992基因轉(zhuǎn)染小鼠心肌細(xì)胞,缺氧細(xì)胞膜損傷,酶釋放WilliamsRS,1993基因轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞,缺氧細(xì)胞存活率,LDH釋放MestrilR,1994轉(zhuǎn)基因小鼠離體心I/R心肌力學(xué),PlumierJC,1995

能量代謝RadfordNB,1996

梗塞面積HatterJJ,1996基因轉(zhuǎn)染(HSC70)H9C2,氧化應(yīng)激膜脂質(zhì)過氧化,酶釋放ChongKY,1998腺病毒心肌內(nèi)注射家兔在體心I/R梗塞面積OkuboS,2001病毒脂質(zhì)體,冠脈內(nèi)大鼠離體心I/R心肌力學(xué),酶釋放JayakumarJ,2000

凋亡SuzukiK,2000HSP70的心肌保護(hù)作用研究

HSP70對(duì)H2O2

所致心肌細(xì)胞核仁損傷的保護(hù)作用HSR+H2O2CtrlHSRFig2-7.EffectsofHSRonnucleolarsegregationinducedbyoxidativestress(10×20).H2O2CtrlH2O23hHSR+H2O23hHSRFig2-11.EffectofHSRonthenucleolarsegregationinHSF1+/+MEFs.Fig2-12.EffectofHSRonthenucleolarsegregationinHSF1-/-MEFs.CtrlHSRH2O23hHSR+

H2O23hpcDNA3.1-HSP70WT,HSP70ΔNLS

pEGFP-HSP70WT,HSP70ΔNLS

pcDNA3.1(-)HSP70WTCtrlH2O23hHSP70ΔNLSHSP70inhibitedH2O2–mediatednucleolarsegregationinC2C12cellsCtrlH2O2HSP70WT

HSP70ΔNLS

B

D

A

C

FluorescentmicroscopyshowingtheintracellulardistributionofHSP70WTandHSP70ΔNLSHSP60/HSP10：

1、H9C2細(xì)胞→腺病毒介導(dǎo)HSP60/HSP10基因轉(zhuǎn)染→缺氧→酶釋放↓，存活率↑（必須兩者同時(shí)轉(zhuǎn)染才有效）（LauSetal,1997)2、腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染→新生大鼠心肌細(xì)胞HSP60/HSP10過表達(dá)→缺氧-再給氧→保護(hù)作用壞死↓(酶釋放↓)

凋亡↓(CytC釋放↓,Caspase-3↓,DNA降解↓)

（LinKMetal,2001）HSP32(hemeoxygenase-1,HO-1)

血紅素氧合酶是催化血紅素分解成膽綠素、膽紅素及CO的限速酶?；?’調(diào)控區(qū)含HSE，受HSF調(diào)控，在氧化應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。

COIronNADP

HO-1

HemeBiliverdin（膽綠素）

Biliverdin

reductase

NADPHNADHO2NADPHBilirubin（膽紅素）NADPNAD1、大鼠心臟→缺血-再灌HSP32表達(dá)↑

大鼠→血紅素注射（i.p）心肌中HSP32↑（2.8倍）→I/R→梗塞面積↓（如同時(shí)給予HO-1抑制劑，則保護(hù)作用被取消）（HangaishiMetal,2000）2、小鼠基因敲除模型→破壞一個(gè)HO-1基因→

HO-1（+/-）小鼠→離體心I/R→心肌力學(xué)恢復(fù)差，CPK釋放↑，梗塞面積↑（YoshidaTetal,2001）

24hr48hr小分子HSP：分子量20～30kD：

HSP27/25αB-晶狀體蛋白（HSP22）

αA-晶狀體蛋白

HSP20MKBP/HSPB2HSPB3

特點(diǎn)：

1、C-末端含有共同的“α-晶狀體蛋白核心結(jié)構(gòu)域”；

2、在橫紋肌中表達(dá)水平高，與胚胎期橫紋肌的分化關(guān)系密切；

3、與細(xì)胞骨架關(guān)系密切。

小分子HSP的心肌保護(hù)研究

1、大鼠心肌缺血→HSP27/25、αB-晶狀體蛋白及MKBP從胞漿向肌原纖維移位，主要分布于閏盤、Z線等處（YashidaKetal,1999）

2、大鼠、豬心肌缺血→αBC的移位伴隨有磷酸化（GolenhofenNetal,1998）

3、L929細(xì)胞，H2O2損傷→HSP27/25的分子伴娘及細(xì)胞保護(hù)作用與其磷酸化狀態(tài)及細(xì)胞中谷胱甘肽水平升高有關(guān)（RogallaTetal,1999;PrevilleXetal,1998）

可跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)的αB-晶狀體蛋白工程蛋白質(zhì)的制備及其對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用pGEX-MTS-αBCpGEX-MTSpF14GGSTMTSFactorXaEcoRIEcoRIEcoRIαBCGSTMTSFactorXaαBCAB1234512kb321.610.50.40.30.20.1αBC載體構(gòu)建

AB45.7KD32.5KD18.4KD123456123←GST-MTS-αBC

←GST←MTS-αBC

←GST-MTS-αBC

←MTS-αBC

78KDABCCelldeathrate(%)LDHrelease(%)*#*#4、新生大鼠心肌細(xì)胞→腺病毒介導(dǎo)αBC基因轉(zhuǎn)染→模擬缺血→CPK釋放↓，微管結(jié)構(gòu)損傷↓（DillmannWHetal,1999）5、αBC轉(zhuǎn)基因小鼠→工作心臟→缺血20min，再灌3hr→心功能改善，梗塞面積↓，凋亡↓（RayPSetal,2001）

熱休克蛋白對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響αBCHSP60HSP27HSP70OtherPathways(From:Kamradtetal,2001;Brueyetal,2000;Pandeyetal2000;Linetal,2001;Xanthoudakisetal1999;Sumlietal,1999;Mosseretal,2000;Salehetal,2000;Nylandstedetal,2000;Pandeyetal,2000;Parketal,2001)HSP90?pcDNA3.1+H2O2(12h)Smac+H2O2(12h)HSP70+H2O2(12h)HSP70+Smac+H2O2(12h)*#**##22222222Fig.7.EffectofHSP70orSmacoverexpressiononthepercentageofapoptoticnucleiinducedbyH2O2.

HSP70的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及其心肌保護(hù)作用研究ContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化HSP70：在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)。HSP60：動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成早期最重要的自身抗原。SchematicrepresentationoftheroleofautoimmuneresponsestoHSP60inatherosclerosis.ContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與炎性疾病HSP在腦膜炎中的表達(dá)PM：化膿性腦膜炎；TM：結(jié)核性腦膜炎；VM：病毒性腦膜炎1.細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白2.細(xì)胞外熱休克蛋白細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白與炎性疾病HSP72對(duì)晚期炎癥介質(zhì)HMGB1釋放和功能的影響細(xì)胞外熱休克蛋白與炎性疾病抗原呈遞作用自身抗原：動(dòng)脈粥樣硬化(a)lysisofthecelloforigin;(b)releaseinvesiclesbya‘‘blebbing’’mechanismfollowedbysubsequentlysisofvesicles;(c)secretionthroughanendolysosomesandreleasewhentheendolysosomefuseswiththecellsurface.Hsp70receptorsCD91：α2巨球蛋白受體，存在于多種免疫細(xì)胞CD40：選擇性識(shí)別HSP70LOX-1：氧化低密度脂蛋白受體，促進(jìn)單核細(xì)胞與HSP70的結(jié)合Effectsofheatshockproteinsondendriticcells,andinductionofpeptide-specificimmunityContentsI.IntroductionofHSPs1.DefinitionofHSPs2.Characteristic3.Classficationanddistributionwithincell4.Functions5.Regulationofexpression

II.HSPsandheartdisease

III.HSPsandatherosclerosis

IV.HSPsandinflammation

V.HSPsandtumor

VI.HSPsandaging

熱休克蛋白與腫瘤ImplicationsinDiagnosis(診斷)Table1.HeatshockproteinsinBreastcancer

:diagnosticimplications

HspFindingsHsp27Correlationwithestrogenreceptors;Overexpression:lowcellproliferation;LackofassociationwithERinmaleBC;Smears,suspiciousofmalignancyHsp70Hsp70andc-myc:in63%ofcarcinomas;AssociatedwithelevationofER;Highcellproliferation;LNmetastasis,poordifferentiationHsp90αOverexpression:LNinvolvementAssociationwithPRisoformsHigher:cancer,correlatedwithcyclinD1Table2.HeatshockproteinsinEndometrial