種子擴大培養(yǎng)課件

第七章

種子擴大培養(yǎng)

7.1種子制備工藝

7.2種子質(zhì)量的控制措施

第七章種子擴大培養(yǎng)1

種子擴大培養(yǎng)是指將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。

目的：使發(fā)酵周期縮短，設備利用率提高種子擴大培養(yǎng)是指將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管2

作為種子的準則是:1)菌種細胞的生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，延滯期短2)生理性狀穩(wěn)定3)菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求4)無雜菌污染5)保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。

作為種子的準則是:3

7.1種子制備工藝種子制備的工藝流程如圖所示，其過程大致可分為：

7.1種子制備工藝47.1.1實驗室種子制備

對于不產(chǎn)孢子的細菌，生產(chǎn)上一般采用斜面營養(yǎng)細胞保藏法。然后再用茄子瓶固體斜面或搖瓶液體擴大培養(yǎng)。對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子。7.1.1實驗室種子制備對于不產(chǎn)孢子的細菌，生產(chǎn)上5（一）孢子的制備1，細菌的制備細菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37?C。細菌菌體培養(yǎng)時間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細菌培養(yǎng)則需要5~10天。（一）孢子的制備1，細菌的制備62，霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28?C。培養(yǎng)時間一般為4~14天。2，霉菌孢子的制備73，放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28?C。培養(yǎng)時間為5~14天。3，放線菌孢子的制備8（二）液體種子制備1，好氧培養(yǎng)：對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐（二）液體種子制備1，好氧培養(yǎng)：92，厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）試管→三角瓶→卡式罐→種子罐2，厭氧培養(yǎng)：對于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）107.1.2生產(chǎn)車間種子制備

實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。7.1.2生產(chǎn)車間種子制備

實驗室制備的孢子或液體種子移種11（1）種子罐級數(shù)的確定

種子罐的作用在于使孢子瓶中有限數(shù)量的孢子發(fā)芽、生長并繁殖成大量菌絲體，接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后能迅速生長，達到一定菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。

種子罐級數(shù)是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，這一般根據(jù)菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。（1）種子罐級數(shù)的確定種子罐級數(shù)是指制備種子需逐級擴12種子擴大培養(yǎng)ppt課件13細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵孢子懸浮液→一級種子罐（27?C,40小時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級種子罐（27?C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子細菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。14確定種子罐級數(shù)需注意的問題種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數(shù)。

確定種子罐級數(shù)需注意的問題15（2）接種齡與接種量

接種量是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度。

通常，接種齡以菌絲處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時較為合適。接種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。（2）接種齡與接種量接種量是指移入的種子液體積和16種子擴大培養(yǎng)ppt課件177.2種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)時間和冷藏時間7.2種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制181，培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量。1，培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因19水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可造成水質(zhì)波動，20措施培養(yǎng)基所用原料要經(jīng)過發(fā)酵試驗合格才可使用嚴格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當溫度下放置一定時間供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復雜的有機氮源措施212，培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37?C培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。2，培養(yǎng)條件（1）溫度22（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對濕度在40%~45%時孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。相對濕度（%）斜面外觀活孢子計數(shù)(億/支)16.5-1925-3640-45上部稀薄,下部略黃上部薄,中部均勻發(fā)白一片白,孢子豐富1.22.35.7不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響（2）濕度相對濕度（%）斜面外觀活孢子計數(shù)(億/支)16233，培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會導致生產(chǎn)能力的下降。措施：孢子培養(yǎng)的時間應該控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。3，培養(yǎng)時間和冷藏時間（1）培養(yǎng)時間24（2）冷藏時間斜面冷藏對孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟程度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4?C冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時間對孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6?C冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。（2）冷藏時間254，接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進而影響菌體的生理狀況。4，接種量26二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量培養(yǎng)基培養(yǎng)條件種齡接種量二、影響種子質(zhì)量的因素及控制孢子的質(zhì)量271，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要選擇有利于孢子發(fā)芽和菌體生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)上要易于被菌體直接吸收和利用；營養(yǎng)成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高營養(yǎng)成分要盡可能與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。1，培養(yǎng)基282，培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供給易被利用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和不足兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級種子罐的通氣量小對發(fā)酵有利。2，培養(yǎng)條件293，種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數(shù)生長期，菌體量還未達到最大值時的培養(yǎng)時間較為合適。時間太長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經(jīng)過多種實驗來確定。嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時最好。3，種齡304，接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發(fā)酵。過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時20~25%4，接種量31三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此首先必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，其次是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。菌種穩(wěn)定性的檢查無（雜菌）檢查三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標是考察其在發(fā)酵罐中所32四、種子質(zhì)量標準1，細胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。四、種子質(zhì)量標準1，細胞或菌體332，生化指標種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。2，生化指標343，產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標，因為種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。3，產(chǎn)物生成量354，酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。4，酶活力36五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢(培養(yǎng)基)菌絲結(jié)團(溶氧)菌絲粘壁(攪拌)五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢(培養(yǎng)基)37第三節(jié)實例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐1，斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機氮而不含或少含糖為原則。(1)斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖0.1％蛋白陳1.0％牛肉膏1.0％氯化鈉0.5％瓊脂2.0~2.5％PH7.0~7.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）(2)培養(yǎng)條件：33~34℃，培養(yǎng)18~24h第三節(jié)實例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴大培養(yǎng)382，一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養(yǎng)基組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。(1)培養(yǎng)基組成葡萄糖2.5％尿素0.5％硫酸鎂0.04％磷酸氫二鉀0.1％玉米漿2.5~3.5％(按質(zhì)增減)硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppmpH7.02，一級種子培養(yǎng)39(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7．6cm、頻率96次／min的往復式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度33~34℃(3)一級種子質(zhì)量要求種齡：12hpH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值0.5以上殘?zhí)牵?.5％以下無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反應。(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200m403，二級種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進而擴大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1)培養(yǎng)基組成3，二級種子培養(yǎng)41(2)培養(yǎng)條件接種量：0.8~1.0％培養(yǎng)溫度：32~34℃培養(yǎng)時間：7~8h通風量50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340r／min；250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r／min500L種子罐1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r／min(2)培養(yǎng)條件42(3)二級種子的質(zhì)量要求種齡7~8hpH7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)(3)二級種子的質(zhì)量要求43二、啤酒酵母的擴大培養(yǎng)一般可采用三級擴大培養(yǎng)，擴大倍數(shù)：第1級到第2級為8-10倍，第2級到第3級為4-6倍。1，實驗室擴大培養(yǎng)二、啤酒酵母的擴大培養(yǎng)一般可采用三級擴大培養(yǎng)，擴大倍數(shù)：第1442，車間擴大培養(yǎng)2，車間擴大培養(yǎng)45第三節(jié)生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模