超氧化物歧化酶在紅豆越橘酵素發(fā)酵工藝中的優(yōu)化

超氧化物歧化酶在紅豆越橘酵素發(fā)酵工藝中的優(yōu)化

紅色越蘭是薔薇科植物科的一種漿果，也被稱(chēng)為紅果和紅豆。酵素是以蔬菜、水果、菌類(lèi)等為原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而制成的，富含多種維生素、礦物質(zhì)、生物酶等生物活性物質(zhì)的食品1儀器和試劑盒1.1lmoe-lra-cLambda365紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)PerkinElmer);DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）；電子分析天平（賽多利斯）；LG10-2.4A高速離心機(jī)（北京京立）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。1.2植物屬virusviti紅豆越橘采收自黑龍江省伊春市，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為杜鵑花科越橘屬植物（Vacciniumvitis-idaeaL.）的果實(shí)；DPPH（上海阿拉?。?；SOD測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；維生素C(V2方法2.1紅豆越橘的制備挑選成熟、無(wú)霉變的紅豆越橘果實(shí)，除去樹(shù)葉、雜質(zhì)，用無(wú)菌水洗去泥沙，勻漿，分別稱(chēng)取50g紅豆越橘置于無(wú)菌密封罐中，按比例加入無(wú)菌水及白砂糖，恒溫下發(fā)酵，每隔2d放氣一次，發(fā)酵終止后過(guò)濾，于紫外燈下照射2h終止發(fā)酵。2.2單因素試驗(yàn)2.2.1發(fā)酵溫度的確定稱(chēng)取紅豆越橘50g，白砂糖10g，料液比1:2，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別在15,20,25,30,35℃恒溫發(fā)酵20d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。2.2.2料液比的確定稱(chēng)取紅豆越橘50g，白砂糖10g,25℃恒溫，分別按料液比2:1,1:1,1:2,1:3,1:4加入無(wú)菌水，按紅豆越橘酵素的制備方法，發(fā)酵20d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。2.2.3白砂糖的添加量稱(chēng)取紅豆越橘50g,25℃恒溫，料液比1:2，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別加入6,8,10,12,14g白砂糖，發(fā)酵20d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。2.2.4發(fā)酵溫度的確定稱(chēng)取紅豆越橘50g，白砂糖10g，料液比1:2,25℃恒溫，按紅豆越橘酵素的制備方法，分別發(fā)酵10,15,20,25,30d，發(fā)酵終止后，測(cè)定其SOD酶活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。2.3正交試驗(yàn)通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定以發(fā)酵溫度、料液比、白砂糖用量及發(fā)酵時(shí)間為考察因素（見(jiàn)表1），選用L2.4dpph自由基容量的測(cè)定2.4.3紅豆越橘酵素稀釋液的制備精密吸取紅豆越橘酵素原液200μl，用蒸餾水定容至10ml，即得紅豆越橘酵素稀釋液。再分別吸取400,500,600,700,800μl稀釋液，定容至10ml，即得紅豆越橘酵素樣品溶液。2.4.4紅豆越橘酵素v清除率的測(cè)定在試管中加入0.15mmol/L的DPPH工作液3.2ml，再加入紅豆越橘酵素樣品溶液0.8ml，混勻后，25℃避光反應(yīng)30min,517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以V清除率（%）=（A式中A2.5紅葡萄糖酶sod活性的測(cè)定將紅豆越橘酵素液4000r/min離心10min，吸取上清，按SOD酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD酶活力。2.6數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理相關(guān)數(shù)據(jù)。3結(jié)果3.1單因素試驗(yàn)的結(jié)果3.1.1發(fā)酵溫度對(duì)紅豆越橘酵素sod酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在15～30℃之間，紅豆越橘酵素的SOD酶活力隨溫度的升高顯著增長(zhǎng)，溫度達(dá)35℃時(shí)，呈驟然下降趨勢(shì)，分析可能是溫度過(guò)高影響酶的活性。3.1.2料液比對(duì)sod酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，隨料液比增加，SOD酶活力值呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)1:2時(shí)，SOD酶活力達(dá)最高值，之后呈緩慢下降趨勢(shì)，分析可能是達(dá)最佳料液比后，隨料液比增加，酵素濃度下降。3.1.3紅豆越橘酵素sod酶活力變化結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，隨白砂糖用量的增加，紅豆越橘酵素的SOD酶活力呈顯著上升趨勢(shì)，當(dāng)白砂糖用量達(dá)10g時(shí)，SOD酶活力值最高，隨后呈緩慢下降趨勢(shì)。3.1.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)赤豆酶sod酶活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，紅豆越橘酵素SOD酶活力值顯著增加，發(fā)酵時(shí)間在25～30d時(shí)，SOD酶活力基本趨于平穩(wěn)。3.2經(jīng)驗(yàn)單因素試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表3、表4。由表3、表4可見(jiàn)，4個(gè)因素對(duì)紅豆越橘酵素影響次序?yàn)镃（白砂糖用量）>A（發(fā)酵溫度）>D（發(fā)酵時(shí)間）>B（料液比），其中白砂糖用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05），發(fā)酵溫度、料液比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。根據(jù)直觀分析結(jié)果，確定最佳工藝條件為A3.3dpph自由基容量測(cè)定結(jié)果紅豆越橘酵素與V3.4結(jié)果表明，紅葡萄糖的sod酶活性紅豆越橘發(fā)酵前SOD酶活力為1488U/ml，按最佳工藝條件發(fā)酵后，SOD酶活力為3624U/ml。4發(fā)酵條件及紅豆越橘酵素抗氧化活性的比較本研究以紅豆越橘果實(shí)為原料，在不添加菌種的條件下，對(duì)紅豆越橘進(jìn)行了自然發(fā)酵，通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)分析，以感官評(píng)價(jià)及SOD酶活力綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，得出最佳發(fā)酵條件：紅豆越橘50g，發(fā)酵溫度30℃，料液比1:1，白砂糖用量8g，發(fā)酵時(shí)間20d。通過(guò)DPPH自由基清除能力及SOD酶活力測(cè)定，對(duì)紅豆越橘酵素的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，發(fā)酵后紅豆越橘酵素SOD酶活力顯著提高，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程能更好地促進(jìn)SOD的形成。結(jié)果表明，紅豆越橘酵素具有較好的抗氧化性能。2.4.1dpph儲(chǔ)備