蛋白質(zhì)相互作用多種方法

蛋白質(zhì)互相作用多種辦法第1頁Proteininteraction：twoormoreproteins(sameordifferent)interactorformcomplex第2頁人類蛋白質(zhì)組相用

有某些蛋白質(zhì)能夠以單體形式發(fā)揮作用，不過大部分蛋白質(zhì)都是和伴侶分子或是與其他蛋白質(zhì)一起發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)有關知識及研究蛋白質(zhì)互相作用必要性第3頁蛋白質(zhì)互相作用：本身具有生物學意義：這樣互相作用在生物體中是起什么作用發(fā)展技術：利用這樣互相作用發(fā)明出某些人為作用第4頁利用生物信息學辦法由繁入簡試驗分析辦法由簡入繁第5頁整體系統(tǒng)部分單體第6頁酵母蛋白質(zhì)互相作用聯(lián)系圖人蛋白質(zhì)互相作用聯(lián)系圖第7頁研究蛋白質(zhì)互相作用目標是發(fā)覺并明確其互相作用生物學意義蛋白質(zhì)互相作用是一種表象，通過表象分析規(guī)律，是研究蛋白質(zhì)互相作用關鍵“種瓜得瓜，種豆得豆”是一種表象，反應了遺傳這樣一種本質(zhì)現(xiàn)象可研究對象合適研究辦法第8頁研究蛋白質(zhì)互相作用需要微觀和宏觀結(jié)合象與象一部分第9頁

研究蛋白質(zhì)互相作用意義1、蛋白質(zhì)間互相作用是細胞生命活動基礎。2、基因只是決定蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)才是發(fā)揮作用主體。蛋白質(zhì)互相作用是發(fā)揮其功能主要活動。第10頁穩(wěn)定互相作用形成蛋白質(zhì)復合體

（proteincomplex）瞬時互相作用（enzyme-substrate）生物學效應穩(wěn)定互相作用與瞬間互相作用共同組成蛋白質(zhì)互相作用內(nèi)涵。第11頁研究蛋白質(zhì)互相作用是為了研究對應生物學功能確定研究目標尋找互相作用建立互相作用網(wǎng)絡和功能體系第12頁從蛋白質(zhì)互相作用到生物學功能。利用蛋白質(zhì)直接互相作用，發(fā)覺互相作用蛋白質(zhì)，再分析這些作用生物學意義。容易犯錯誤：研究一大堆蛋白互相作用，卻不懂得這些互相作用有什么生物學意義。從生物學功能到蛋白質(zhì)互相作用。通過變化生物學現(xiàn)象，分析蛋白質(zhì)間遺傳互相作用，深入研究有關蛋白質(zhì)互相作用。容易犯錯誤：找到了平行變化不有關蛋白質(zhì)。第13頁免疫共沉淀噬菌體展示技術酵母雙雜交技術基因外抑制子合成致死篩選分子生物學辦法Pulldown試驗遺傳學辦法蛋白質(zhì)互相作用研究辦法生物物理學辦法串聯(lián)親和純化第14頁

免疫共沉淀

（co-immunoprecipitation，CO-IP）

當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間互相作用被保存了下來。假如用蛋白質(zhì)X抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合蛋白質(zhì)Y也也許沉淀下來。蛋白質(zhì)Y沉淀是基于與蛋白質(zhì)X物理性互相作用，稱為免疫共沉淀。

第15頁Westernblot：變性抗原，主要用于檢測蛋白質(zhì)存在是否。免疫共沉淀：非變性抗原，用于判定不一樣蛋白質(zhì)間互相作用。多采取非離子變性劑（NP40或TritonX-100)第16頁免疫共沉淀檢測蛋白質(zhì)原理和常見問題YABAYBY非特異性第17頁試驗過程第18頁試驗過程（1）加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min,細胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；（2）取少許裂解液以備Westernblot分析，剩下裂解液加1μg對應抗體加入到細胞裂解液，4°C遲緩搖晃孵育過夜；（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min；（4）將預處理過10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜細胞裂解液中4°C遲緩搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連；（5）免疫沉淀反應后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析。第19頁實驗關鍵1、試驗最需要注意點就是抗體性質(zhì)?？贵w不一樣和抗原結(jié)合能力也不一樣，尤其是多抗特異性是問題。2、為避免蛋白分解、修飾，溶解抗原緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進行試驗。3、考慮抗體/緩沖液百分比?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘余在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。第20頁主要用于：兩種感愛好蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)存在互相作用；也用于判定一種特定蛋白質(zhì)未知互相作用蛋白。

注意：1要求在一系列清洗過程中保持蛋白質(zhì)復合體不變。由于出現(xiàn)假陽性概率比較高。

2設置對照：在對照組中使用對照抗體，以缺失目標蛋白細胞系作為陰性對照等等。第21頁Westernblot1、電轉(zhuǎn)移效率2、PVDF膜充足浸潤3、轉(zhuǎn)移液中有太多SDS4、膜損壞5、轉(zhuǎn)移時膠和膜沒有完全接觸6、抗體問題7、抗體濃度太高或太低8、還原性物質(zhì)存在9、封閉不充足第22頁長處：1、互相作用蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾，處于天然狀態(tài)；2、蛋白互相作用是在自然狀態(tài)下進行，能夠避免人為影響；3、能夠分離得到天然狀態(tài)互相作用蛋白復合物。第23頁缺陷：1、也許檢測不到低親和力和瞬間蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)互相作用；2、兩種蛋白質(zhì)結(jié)合也許不是直接結(jié)合，而也許有第三者在中間起橋梁作用；3、如用westernblot檢查，必須在試驗前預測目標蛋白是什么，以選擇最后檢測抗體，若預測不正確，試驗就得不到成果，辦法本身具有冒險性，敏捷度不如親和色譜高。第24頁

GSTpull-down技術

1988年Smith等利用GST融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白,從此GST融合蛋白在研究蛋白質(zhì)互相作用領域得到極大推廣(His也常用)。此辦法是一種行之有效驗證酵母雙雜交系統(tǒng)體外試驗技術。還應當在體內(nèi)用單獨辦法，如免疫共沉淀加以證明。

第25頁靶蛋白X基因亞克隆到帶有GST基因原核體現(xiàn)載體中，并在細菌中體現(xiàn)GST融合蛋白（GST-X）把GST融合蛋白(探針、誘餌蛋白)掛到帶有GST底物Sepharosebeads上，然后把另一種含目標蛋白質(zhì)（捕捉蛋白）溶液加入其中。由于谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST融合蛋白，如發(fā)生互相作用則形成復合物：GST-X-Y，沉淀搜集下來，洗脫非特異結(jié)合蛋白后采取SDS判定與誘餌蛋白質(zhì)互相作用蛋白質(zhì)。原理第26頁GST-Pulldown

Assay右：對照，中間翻轉(zhuǎn)混合時發(fā)生互相作用，膠上只與GST融合蛋白結(jié)合而不與GST結(jié)合特異性條帶表達新互相作用蛋白。第27頁GSTpulldownGSTFusionProteinPurificationbindingwashelution第28頁GSTpulldownGSTfusionprotein不夠純，用作bait會產(chǎn)生太多非特異性蛋白質(zhì)污染。第29頁檢測GST融合蛋白與靶蛋白互相作用：1、放射性標識融合蛋白：迅速簡單易行2、抗GST抗體檢測3、生物素標識融合蛋白：沒有放射性，但也許對探針蛋白和其他蛋白互相作用有影響。第30頁應用：一確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間新互相作用；一是判定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用。第31頁特點：比較簡便，假如用抗GST抗體檢測或生物素標識融合蛋白避免了使用同位素等危險物質(zhì)，在蛋白質(zhì)互相作用研究中有很廣泛應用。融合蛋白具有高通量性、高選擇性特點，由于融合蛋白多樣性以及體現(xiàn)系統(tǒng)多樣性(如細菌、果蠅、哺乳動物)，該辦法能夠研究蛋白質(zhì)在復雜體系中互相作用。

注意：該辦法成功應用取決于是否能夠得到足夠多，并且保持蛋白質(zhì)活性重組融合蛋白，且無過度降解（探針蛋白變成不一樣降解產(chǎn)物混合物）和不溶，以及如何避免內(nèi)源性誘餌蛋白干擾。第32頁串聯(lián)親和純化（TAP）近年來質(zhì)譜技術發(fā)展迅速，其功能強大且敏捷度高，常用來判定互相作用蛋白質(zhì)復合體或復合體亞基，但一般難以取得足夠量純化蛋白質(zhì)復合體，成為質(zhì)譜在這方面應用一種限速步驟。1999年Rigaut（德國）等人共同提出了一套分離復合蛋白新辦法—串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification，TAP)，兼具標準親和純化（能夠得到高純度地拷貝數(shù)蛋白質(zhì)復合體）和免疫共沉淀（用于特異性標識蛋白與親和柱之間互相作用）兩種生化辦法長處，為蛋白質(zhì)復合體分離判定提供了一條新途徑。

第33頁適用：研究蛋白質(zhì)復合體中多種蛋白質(zhì)間互相作用，尤其適用于研究蛋白質(zhì)在生理條件下互相作用第34頁首先通過基因工程給被分離純化蛋白一端加一種TAP標簽，該標簽由IgG結(jié)合構造域(ProtA)及一種鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(CBP)組成，構造域與多肽之間由一種TEV蛋白酶切位點隔開。原理辦法

第35頁第36頁

1、基因重組將細胞內(nèi)源性目標蛋白基因置換為帶有TAP標簽基因，溫和裂解細胞，獲取細胞抽提物。

2、將抽提物加入IgG親和柱，TAP標簽ProtA端會與IgG形成強結(jié)合，在用洗脫液洗脫掉大部分非特異性結(jié)合物和雜蛋白。

試驗流程第37頁3、具有TEV蛋白酶洗脫夜將蛋白質(zhì)復合體切割下來。在鈣離子參與下，被切割下來帶有CBP蛋白質(zhì)復合體與鈣調(diào)蛋白緊密結(jié)合，充足洗脫，就能夠深入清除非特異作用蛋白質(zhì)雜質(zhì)，最后純化出高純度目標蛋白復合體。4、通過串聯(lián)親和純化目標蛋白，通過SDS或者雙向電泳分離之后，找出與目標蛋白互相作用蛋白質(zhì)，采取質(zhì)譜分析辦法對其進行分析判定。第38頁Mammalian

Tap-tag-LC-MS/MS

method第39頁

TAP長處加工和修飾過蛋白能夠作誘餌，互相作用發(fā)生在天然環(huán)境和細胞部位，一次操作能夠分離和分析多組分復合物，得到廣泛應用，由于TAP標簽高度特異性以及采取兩步洗脫純化法，在純化過程中不需要強烈沖洗，因此能夠更加好地保持較不穩(wěn)定蛋白質(zhì)復合物，并且非特異蛋白量也會很低，這是一步純化法所不能比擬。克服了雙雜交篩選步驟復雜、假陽性成果較多、難于量化、不能滿足大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究需要缺陷。第40頁TAP缺陷更傾向于高豐度和穩(wěn)定互相作用，許多低親和力、瞬時和依賴特殊細胞環(huán)境互相作用也許檢測不到。另外，TAP必須采取能產(chǎn)生體現(xiàn)TAP標簽蛋白，這種標簽蛋白體現(xiàn)最佳接近生理水平，因此最佳將帶標簽基因用天然啟動子體現(xiàn)。但在哺乳動物細胞中，天然啟動子體現(xiàn)標簽蛋白是非常困難，其體現(xiàn)水平不一樣于無標簽內(nèi)源蛋白，由非生理水平誘餌蛋白而產(chǎn)生假陽性。第41頁親和純化（affinitypurification

）純化：

抗體

Epitope-tag：flag,myc,HA,V5,GST…

核酸Pull-downImmunoprecipitationTAP(TandemAffinityPurification)

第42頁酵母雙雜交（Yeasttwo-hybrid

）

1989年Field等發(fā)明了酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)利用了酵母生長轉(zhuǎn)錄因子GAL4具有兩個構造域,DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因或具有靶基因cDNA分別構建在含BD及AD質(zhì)粒載體上,將這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞,若BD結(jié)合誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼蛋白互相作用、彼此間結(jié)合時,則會造成位于側(cè)翼BD與AD在空間上接近,展現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子完全活性,啟動下游報告基因如His及LacZ等基因體現(xiàn),從而在特定缺陷培養(yǎng)基上生長。一、酵母雙雜交系統(tǒng)基本原理第43頁典型真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都具有二個不一樣構造域:DNA結(jié)合構造域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活構造域(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上特異17bp長序列（UAS），并使轉(zhuǎn)錄激活構造域定位于所調(diào)整基因上游，轉(zhuǎn)錄激活構造域可同轉(zhuǎn)錄復合體其他成份作用，啟動它所調(diào)整基因轉(zhuǎn)錄。第44頁第45頁His,β-gal第46頁BD和AD功能上互相獨立又互相依賴，只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整轉(zhuǎn)錄因子活性第47頁據(jù)此可將兩個待測蛋白（X和Y）分別與這兩個構造域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y），并共體現(xiàn)于同一種酵母細胞內(nèi)，假如兩個待測蛋白間能互相作用，就會通過待測蛋白橋梁作用使AD與BD形成一種完整轉(zhuǎn)錄激活因子，并激活對應報告基因體現(xiàn)。通過對報告基因檢測就可很容易懂得待測分子間是否發(fā)生了互相作用。深入用已知蛋白X作為誘餌，分離取得與之互相作用蛋白質(zhì)Y及其編碼序列。第48頁His,β-gal第49頁二、酵母雙雜交系統(tǒng)組成與BD融合蛋白體現(xiàn)載體誘餌蛋白baitprotein與AD融合蛋白體現(xiàn)載體靶蛋白preyprotein帶有多種報告基因宿主菌株

HIS3、URA3、LacZ和LEU2等第50頁報告基因LacZreporter-Blue/WhiteScreeningHIS3reporter-ScreenonHis+media(usuallyneedtoadd3ATtoincreaseselectivity)LEU2reporter-ScreenonLeu+mediaADE2reporter-ScreenonAde+mediaURA3reporter-ScreenonUra+media(candonegativeselectionbyaddingFOA)第51頁第52頁

X-β-半乳糖苷酶藍白斑顯色分析舉例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD第53頁Yeasttwo-hybrid（酵母雙雜交）應用

發(fā)覺新互相作用蛋白質(zhì)

判定和分析已有蛋白質(zhì)間互相作用

確定蛋白質(zhì)間互相作用功能基團第54頁lacZUASDBADlacZUASADDBlacZlacZUASADYDBXlacZ第55頁發(fā)覺新互相作用蛋白質(zhì)BDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADYlacZDBB-prBDB-PrMarker1AD基因庫Marker2lacZUASADlacZDBB-prBDB-PrMarker1YAD基因庫Marker2第56頁文庫篩選步驟1、將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白DNA結(jié)合域融合構建誘餌質(zhì)粒。2、將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子酵母細胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化酵母。3、再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。4、通過報告基因功能篩選互相作用蛋白。第57頁確定蛋白質(zhì)間互相作用功能基團ProteinA1234BDB-PrMarker1AD1Marker2AD2Marker2AD3AD3白蘭白白第58頁判定和分析已有蛋白質(zhì)間互相作用BDB-PrMarker1ADA-PrMarker2蘭：互相作用白：不互相作用第59頁序列分析

從酵母中分離質(zhì)粒然后轉(zhuǎn)化E.coli從大腸桿菌中提取質(zhì)粒并測序在數(shù)據(jù)庫中比對所測定序列與已知蛋白同源性第60頁酵母雙雜交測序成果酵母雙雜交得到陽性克隆子質(zhì)粒通過DNA測序，由NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST檢索cDNA編碼蛋白質(zhì)舉例第61頁測序成果查詢過程cDNA序列NCBIBLASTNucleotidemegablastsearchformatresults第62頁Blast舉例第63頁Results舉例第64頁長處

1、迅速取得互相作用蛋白基因2、只需單一步驟質(zhì)粒構建3、檢測在真核活細胞內(nèi)進行,在一定程度上

代表細胞內(nèi)真實情況。4、作用信號是在融合基因體現(xiàn)后,在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子作用而給出,省去了純化蛋白質(zhì)繁瑣步驟第65頁5、檢測成果能夠是基因體現(xiàn)產(chǎn)物積累效應,因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間薄弱或臨時互相作用。6、酵母雙雜交系統(tǒng)可采取不一樣組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫,能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不一樣亞細胞部位及功能蛋白。7、通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定酶使信號放大。同步,酵母表型,X—Gal及HIS3蛋白體現(xiàn)等檢測辦法均很敏感第66頁不足1、雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間互