亞麻種質(zhì)資源的rapd引物篩選

亞麻種質(zhì)資源的rapd引物篩選

0dna指紋圖譜鄭和是天麻科的一種一級植物。它是世界上最古老的纖維植物之一，被稱為“纖維女王”。目前中國現(xiàn)有的亞麻種質(zhì)資源3000多份,很多栽培品種從種子和植株形狀上很難區(qū)分開,亞麻種質(zhì)資源是亞麻育種和生產(chǎn)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ),因此迫切地需要找到一種快速、準確的鑒定亞麻種質(zhì)的有效方法。DNA指紋圖譜是一種能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜,可直接反映生物的遺傳物質(zhì)在DNA分子水平上的差異。它是建立在DNA分子標記基礎(chǔ)之上的,多態(tài)性豐富,與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法相比,具有高度的個體特異性、環(huán)境穩(wěn)定性,還有快速、準確等優(yōu)點,是鑒定種質(zhì)資源、品種、品系的有力工具RAPD標記技術(shù)已廣泛應(yīng)用到各種生物的研究中,在檢測物種的多樣性、生物分類、構(gòu)建基因圖譜、進行基因定位以及構(gòu)建遺傳連鎖圖等研究中得到應(yīng)用。陳一華等目前亞麻種植資源的開發(fā)鑒定和評價研究還沒有得到很好的完善,利用分子標記對亞麻進行遺傳分析,探討其在亞麻種質(zhì)資源鑒定研究中的可靠性及適用性,并篩選出可以鑒別品種的特異引物,探索有效鑒別亞麻品種的標記和方法,對亞麻種質(zhì)資源的分類研究及亞麻品種的鑒定都具有重要意義。本研究利用1480條RAPD標記對來源于世界不同國家和地區(qū)的26份亞麻品種及種質(zhì)資源進行引物篩選、多態(tài)性分析,并初步建立了亞麻RAPD標記分子身份證體系,為亞麻種質(zhì)資源的保存、鑒定、研究和利用提供理論依據(jù),也為品種鑒定、遺傳育種、遺傳工程利用提供有益參考。1材料和方法1.1試驗材料26份材料的名稱、來源見表1。所選的26個品種是來自不同國家。1.2方法1.2.1亞麻基因組dna的提取取亞麻幼苗適量,采用OMEGA植物DNA提取試劑盒提取亞麻基因組DNA。用0.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性和純度,并用紫外分光光度儀檢測。將DNA濃度稀釋為25ng/μL,-20℃冰箱中保存、備用。1.2.2生物公司的紡粘設(shè)備實驗所用的1480條RAPD隨機引物購自上海生工和英俊生物公司。RAPD反應(yīng)體系20μL:25ng/μL模板DNA1μL,10μmol/L引物2μL,10μmol/LdNTP0.5μL,10×PCR緩沖液(含Mg1.2.3脂糖凝膠電泳RAPD標記的PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析,1×TBE電泳緩沖液,電壓80V,電泳100min,EB染色15min,紫外透射儀照相。1.3建立數(shù)據(jù)組合矩陣根據(jù)PCR擴增結(jié)果,對清晰可見的條帶全部采用人工讀帶的方式統(tǒng)計分析,不穩(wěn)定的條帶或弱帶不進行統(tǒng)計,在相同的遷移率位置上,某一擴增條帶出現(xiàn)時賦值為1,無帶賦值為0;建立原始的0-1的數(shù)字矩陣。將100bp梯度間距以大致5bp分為最小識別單位,估計擴增片段的大小。據(jù)RAPD分子標記的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,采用統(tǒng)計分析軟件NTSYS-2.10對26份材料的遺傳相似性進行分析,以共有片段比例為指標計算材料之間的遺傳相似性系數(shù),根據(jù)遺傳相似性系數(shù),通過NTSYS2.10用非加權(quán)類平均法(unweightedpairgroupofarithmetiemenas,UPGMA)進行聚類分析,并繪制成樹狀圖。2結(jié)果與分析2.12份亞麻材料間的擴增利用26個亞麻材料的混合DNA對1480條RAPD隨機引物進行初步篩選,得到條帶數(shù)多、條帶較清晰的引物334個,再用這334個引物對26份亞麻材料進行擴增,篩選出了多態(tài)性好、條帶清晰的引物32個(表2)。32個引物共擴增出穩(wěn)定、清晰的185條帶,條段數(shù)在3~11之間,平均每個引物擴增出5.7條帶,其中差異條帶有79條,多態(tài)性比率為44.4%。引物S1270(圖1)和S1238擴增條帶數(shù)最多,分別為11條和9條。多態(tài)性最好的引物是ST09(圖2),6條帶有5條為多態(tài)性帶,多態(tài)性比率達83.3%。2.22個亞麻品種的親緣關(guān)系利用32個RAPD引物對26份亞麻材料進行聚類分析,從聚類樹狀圖(圖3)可以看出,其遺傳相似性系數(shù)變異范圍在0.51~0.97之間。其中AGATHA與中亞麻1號的遺傳相似性系數(shù)最大為0.963,表明這兩個品種的親緣關(guān)系較近。而在這些亞麻品種中遺傳相似性系數(shù)最小的為派克斯與AlfonsoINTA,為0.512,則表明它們之間的親緣關(guān)系較遠。在聚類樹狀圖中,當遺傳相似性系數(shù)約為0.67時,這26個亞麻品種可分為3個類群:第Ⅰ類群包括兩個品種,分別是LineNo.7和AlfonsoINTA。第Ⅱ類群也包括兩個品種,分別Y7I118和Y7I117。其余的22個品種為第Ⅲ類群,在第Ⅲ類群中,ленок與其余的21個品種的遺傳相似性系數(shù)較小,表明在這個類群中ленок與其他的品種親緣關(guān)系較遠。RAPD標記聚類分析的結(jié)果在多數(shù)品種中反映了不同來源材料間的親緣關(guān)系。2.32份材料rapd核心引物的分子身份證編碼在篩選出的32個RAPD引物中選出多態(tài)性好,特異性好的10個核心引物,編號分別為:S1047、S1230、S1238、S1270、S1314、S1353、S2105、SC07、SH04、ST09。以在相同遷移位置上條帶的有無來構(gòu)建26個亞麻材料的指紋圖譜(圖4)。用這10個RAPD核心引物的的指紋組合,就可以鑒別供試的亞麻品種。有的材料只要利用一個RAPD引物就可以鑒別出來,而有的品種則需要利用這10個核心引物的相互組合才能區(qū)分。對于某一品種,10個核心引物的特異帶型組合就是該品種的DNA指紋圖譜。利用10條RPAD核心引物對26個不同材料擴增的01(二進制)數(shù)據(jù),從上之下輸入通過計算轉(zhuǎn)化成十進制的數(shù)據(jù),例如品種1的二進制的數(shù)值為:11111111110100010101110011100010100111011111111111011000011101110101011,共71位數(shù)字。將這71位二進制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為十進制數(shù)值為:2359502960407975050155,共計22位。26分材料的十進制分子身份證(表3)。這些十進制的數(shù)字串連起來就構(gòu)成了各個材料的分子身份證。比較兩種數(shù)字可以看出:數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后,數(shù)據(jù)位數(shù)由71變?yōu)?2,約減少了2/3,兩種數(shù)字所表達的信息是一樣的,因此用十進制數(shù)字表示可以更直觀,也有利于種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫的建立。至此,亞麻RAPD標記分子身份證體系初步建立。3份材料rapd標記分子身份證構(gòu)建RAPD標記應(yīng)用比較早,技術(shù)比較成熟,方法簡便,易于操作。本試驗研究結(jié)果表明,32個RAPD引物共擴增出185條帶,多態(tài)性條帶79個,平均多態(tài)性比率達44.4%。據(jù)遺傳相似性系數(shù)構(gòu)建26分亞麻材料的聚類分析結(jié)果,可將種質(zhì)材料劃分為三個類群,其中第一類群的品種與其他兩類群品種的親緣關(guān)系較遠。其分類結(jié)果與形態(tài)差異有一定相關(guān)性。同時用10個引物可以完全將26份材料分開,可看出RAPD標記的條帶比較多,特異條帶組合的多態(tài)性較好,有利于亞麻品種的鑒別。在篩選出的32個RAPD引物中選出多態(tài)性好,特異性好的10個核心引物,編號分別為:S1047、S1230、S1238、S1270、S1314、S1353、S2105、SC07、SH04、ST09。以在相同遷移位置上條帶的有無構(gòu)建了26份亞麻材料的DNA指紋圖譜,并將條帶的有或無轉(zhuǎn)化成1或0,構(gòu)成了一組71位數(shù)二進制數(shù)據(jù),將每份材料的二進制數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為十進制數(shù)據(jù),構(gòu)成了每份材料的分子身份證,在轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)中沒有重