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微生物試驗報告產(chǎn)青霉素酶桿菌分離、優(yōu)化、誘導(dǎo)及酶活測定第1頁一二三四點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本目錄試驗成果試驗操作分析討論介紹第2頁一、介紹枯草芽孢桿菌廣泛分布于土壤及腐敗有機物中，易在枯草津汁中繁殖而得名。本試驗中通過從土樣中取得枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生青霉素酶，并且青霉素和磷酸鹽對其有誘導(dǎo)作用，本試驗中通過青霉素對其誘導(dǎo)，從而進行菌種優(yōu)化。第3頁一、介紹青霉素酶是β-內(nèi)酰胺酶1種,其作用機理是水解β-內(nèi)酰胺類抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失去其活性，是致病菌產(chǎn)生耐藥性主要原因之一，因此對青霉素酶研究在青霉素用于臨床很快便全面展開了。人們在研究青霉素酶過程中，除了發(fā)覺它有害一面外，也發(fā)覺了某些有利方面。如:在β-內(nèi)酰胺類抗生素藥品質(zhì)量檢查中，利用青霉素酶進行無菌檢查是一種非常有效、簡便、快捷辦法，可定量檢查出青霉素類藥品中污染微生物程度。因此研究青霉素酶有了另一番意義。青霉素作誘導(dǎo)劑使用，細胞上特殊接收體與青霉素結(jié)合成份(penicillin2bindingcomponent,PBC)相同，可用青霉素結(jié)合成份與誘導(dǎo)劑“親和力”不一樣來解釋青霉素酶產(chǎn)率高低。PBC與誘導(dǎo)劑相結(jié)合是青霉素酶合成過程中很主要影響原因之一。第4頁二、試驗過程如圖為大體操作過程第5頁二、試驗過程

試驗日程4月8日青霉素濃度梯度平板制備，斜面培養(yǎng)基配制，滅菌。4月9日采集土壤樣品及土壤樣品處理，將所得試驗所用菌液用平面

涂布法接種到做好培養(yǎng)皿上，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。4月15日鏡檢。挑取桿菌接種到10單位梯度培養(yǎng)基上。4月22-5月5日優(yōu)化菌種。增加青霉素素濃度度從10、20、50、100、500、

1000、2023、5000、10000、20230單位進行反復(fù)優(yōu)化，

增加枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶能力，并將10000萬單位菌種進行斜面保存。5月6日-13日搖瓶發(fā)酵。對上面得到10000單位菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)，并

對發(fā)酵液稀釋后進行酶活測定。5月13日-17日菌株誘變5月20日將一萬單位保存菌種放入1000、2023、4000、8000、

10000單位青霉素液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并觀測菌種生長情況第6頁二、試驗過程①器材：37℃恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、分析天平、堿式滴定管、高壓滅菌鍋、接種環(huán)、三角瓶、移液槍、注射器、培養(yǎng)皿、三角棒、酒精燈、移液管、洗耳球、恒溫水浴鍋、電磁爐、電磁鍋、烘箱等。②材料：土壤（30教旁草地土）160萬單位/0.96g青霉素、硫代硫酸鈉固體、碘固體、可用性淀粉。第7頁二、試驗過程細菌培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

蒸餾水1000mL（若為固體培養(yǎng)基，加20g瓊脂），pH7.4

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

瓊脂20g

蒸餾水1000mL,pH7.4第8頁二、試驗過程發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15g甘油50g

氯化鈉4g0.1％硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)溶液0.5ml

枸櫞酸鈉5.88g20％硫酸鎂(MgSO4·7H2O)溶液1ml

磷酸氫二鉀4g肉浸液1000ml

對于上面3種培養(yǎng)基，為了合適枯草芽孢桿菌生長和產(chǎn)酶，進行pH調(diào)整。滅菌后pH7.0～7.2（由于滅菌后不好調(diào)pH，因而滅菌前調(diào)pH7.2～7.4，查資料知滅菌后pH降0.2左右）第9頁點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

二、試驗過程從土壤中分離菌種并接種培養(yǎng)

涂布培養(yǎng)青霉素濃度梯度平板制備青霉素溶液制備處理土樣，取得菌液第10頁點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本

二、試驗過程菌種篩選鏡檢水洗干燥染色固定涂片菌種篩選第11頁二、試驗過程細菌培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

蒸餾水1000mL（若為固體培養(yǎng)基，加20g瓊脂），pH7.4

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉4g

瓊脂20g

蒸餾水1000mL,pH7.4第12頁二、試驗過程菌種優(yōu)化

10單位保存菌種（1萬單位）500、1000

單位（固液）20、50、100單位1萬、2萬單位斜面培養(yǎng)基配制：配制150ml斜面培養(yǎng)基（配方見試驗材料）、倒入試管中（約占試管1/3體積），121℃高壓滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻到45℃左右后，擺成斜面后備用。第13頁二、試驗過程搖瓶發(fā)酵1、配制100ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基3個，121℃滅菌30min，配方如上面試驗材料，然后加入加入上述配得10萬單位青霉素溶液10ml，得到1萬單位青霉素液體發(fā)酵培養(yǎng)基。2、將保種1萬單位青霉素接種到發(fā)酵培養(yǎng)基上，放入恒溫搖床培養(yǎng)24h。3、觀測個培養(yǎng)基渾濁成度。9、對發(fā)酵液處理，進行下面酶活力測定。第14頁二、試驗過程青霉素酶活力測定準備工作：1、青霉素酶溶液制備2、磷酸鹽緩沖液(pH7.0)制備3、醋酸鈉緩沖液(pH4.5)4、碘滴定液制備5、硫代硫酸鈉滴定液配制6、青霉素溶液配制第15頁二、試驗過程測定：試驗組：精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，預(yù)熱至37℃后，精密加入已預(yù)熱青霉素酶稀釋液25ml，迅速混勻，在37℃精確放置1小時，精密量取3ml，立即加至已精密量取碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸鈉緩沖液(pH4.5)稀釋至刻度］25ml中,在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉批示液，繼續(xù)滴定至藍色消失?？瞻捉M：取已預(yù)熱青霉素溶液2ml，在37℃放置1小時，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加青霉素酶稀釋液1ml，在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定。第16頁二、試驗過程計算辦法：E＝(B－A)×M×F×D×100

E為青霉素酶活力，單位／(ml.小時)；B為空白滴定所消耗上述硫代硫酸鈉滴定液容量，ml；A為樣品滴定所消耗上述硫代硫酸鈉滴定液容量，ml；M為硫代硫酸鈉滴定液濃度，mol/L；F為在相同條件下，每1ml上述碘滴定液(0.01mol/L)相稱于青霉素效價單位；D為青霉素酶溶液稀釋倍數(shù)。

第17頁紫外誘變繁殖體取得點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本點擊添加文本二、試驗過程倒、涂平板菌株誘變25℃培養(yǎng)第18頁二、試驗過程再搖瓶培養(yǎng)由于誘變未得到想要菌種，為證明取得了耐1萬單位/ml菌種，對保存1萬單位菌種進行搖瓶培養(yǎng)觀測成果。1.配制5管5ml液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻。2.分別加入0.5ml、0.4ml、0.2ml、0.1ml、0.05ml,10萬單位青霉素溶液，得到10000、8000、4000、2023、1000單位青霉素培養(yǎng)液。3.挑去保存10000單位菌種接種后，37℃，搖瓶培養(yǎng)24h觀測菌種生長情況。第19頁三、試驗成果篩選成果第20頁三、試驗成果菌種優(yōu)化成果第21頁三、試驗成果酶活力測定成果三個發(fā)酵培養(yǎng)菌液進行測酶活，對比后酶活最大一種。發(fā)酵培養(yǎng)基酶活力：①成果數(shù)據(jù)統(tǒng)計：稀釋1000倍D=1000B-A=0.2ml硫代硫酸鈉滴定B液濃度0.01mol/L（經(jīng)硫代硫酸鈉直接滴定碘精確測出濃度）碘滴定液濃度0.01mol/L②計算：E=(B－A)×M×F×D×100=0.2×0.01×742×1000×100=148400單位／(ml.小時)