第04章 蛋白質的共價結構

第04章蛋白質的共價結構蛋白質的共價結構

網(wǎng)絡教程第04章蛋白質的共價結構章節(jié)目錄一、蛋白質通論二、肽三、蛋白質一級結構的測定四、蛋白質的氨基酸序列與生物功能五、肽和蛋白質的人工合成第04章蛋白質的共價結構（一）蛋白質的化學組成和分類化學組成：碳50%

氫7%

氧23%

硫0~3%

其他微量蛋白質的平均含氮量為16%蛋白質含量=蛋白質×6.25胰凝乳蛋白酶

膠原蛋白一、蛋白質通論第04章蛋白質的共價結構按組成分：單純蛋白；綴合蛋白按生物學功能分：酶、調節(jié)蛋白、轉運蛋白、貯存蛋白、收縮和游動蛋白、結構蛋白、支架蛋白、保護和開發(fā)蛋白、異常蛋白蛋白質發(fā)分類單純蛋白：清蛋白；球蛋白；谷蛋白；組蛋白；硬蛋白等綴合蛋白：糖蛋白；脂蛋白；核蛋白；磷蛋白；金屬蛋白；血紅素蛋白等第04章蛋白質的共價結構

蛋白質根據(jù)性質和溶解度可分為1

纖維狀蛋白質結構蛋白，大部分不溶于水膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白2

球狀蛋白質功能蛋白，大部分溶于水各種酶、血紅蛋白等3

膜蛋白結構與功能蛋白，存在于膜上蛋白質表面存在疏水殘基，能與磷脂分子結合（疏水作用）

蛋白質的形狀和大小第04章蛋白質的共價結構核糖核酸酶5700病毒外殼蛋白血紅蛋白

64500蛋白質的形狀和大小第04章蛋白質的共價結構基本結構：一級（1o）結構多肽鏈的氨基酸序列二級（2o）結構多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的α螺旋和β折疊股片段三級（3o）結構多肽鏈借助各種非共價鍵彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象四級（4o）結構指寡聚蛋白質中個亞基之間在空間上的相互關系和結合方式一級結構決定高級結構，高級結構決定蛋白質的功能蛋白質構象和蛋白質結構的組織層次第04章蛋白質的共價結構ABα-螺旋Cβ-折疊股A.α-螺旋和β-折疊股B.核糖核酸酶C.血紅蛋白第04章蛋白質的共價結構蛋白質生物學功能：催化、調節(jié)、轉運、貯存、運動、結構成分、支架作用、防御和進攻、異常功能一級結構二級結構三級結構四級結構氨基酸順序α螺旋多肽鏈寡聚蛋白血紅蛋白結構蛋白質功能的多樣性第04章蛋白質的共價結構（一）肽和肽鍵的結構加水分解脫水縮合

氨基酸脫水縮合成肽肽鍵二、肽第04章蛋白質的共價結構絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-甘氨酰-亮氨酰氨基端（N

端）羧基端（C

端）肽和肽鍵的結構第04章蛋白質的共價結構肽單位構型N-末端C-末端第04章蛋白質的共價結構肽平面處于穩(wěn)定的伸展構象肽平面處于一種不穩(wěn)定的構象多肽主鏈在構象上受到很大限制第04章蛋白質的共價結構NCC

HNC

肽鍵雖是單鍵卻具有局部雙鍵性質O肽鍵周邊六個原子在同一平面上前后兩個氨基酸的α-碳在對角

(trans)Csp2sp2肽鍵的特性第04章蛋白質的共價結構以單鍵表示肽鍵以共振雜化形式表示肽鍵(反式)以雙鍵表示肽鍵肽的C-N鍵略短：共振雜化限制繞肽鍵自由旋轉肽鍵具有部分雙鍵性形成肽平面肽鍵存在永久偶極

肽鍵共振雜化意義：肽鍵以共振雜化形式存在第04章蛋白質的共價結構

HCCNCOp軌道電子共振使肽鍵具雙鍵特性第04章蛋白質的共價結構SNH2GlyLeuProCysAsnGlnIleCysTyrSSNH2GlyArgProCysAsnGlnPheCysTyrSArgPheProSerPheGlyProArgPro牛催產(chǎn)素牛加壓素舒緩激肽

一些肽類激素的結構天然存在的活性肽(1)第04章蛋白質的共價結構COOHCHNH2CH2CH2CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCH2SHαβγ谷氨酸半胱氨酸甘氨酸G-SH+HS-G2H2HG-S-S-G谷胱甘肽

G-SH細胞內重要的還原劑天然存在的活性肽(2)第04章蛋白質的共價結構一般測定步驟：

（1）測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目

（2）拆分蛋白質分子的多肽鏈

（3）斷裂多肽鏈內的二硫橋

（4）分析每一多肽鏈的氨基酸組成

（5）分析多肽鏈的N-末端和C-末端殘基（6）多肽鏈斷裂成肽段（7）測定各個肽段的氨基酸序列（8）重建完整多肽鏈的一級結構（9）確定半胱氨基酸殘基間形成的S－S交聯(lián)橋的位置

一、蛋白質測序的策略

測定蛋白質一級結構、樣品均一、純度97%以上、已知分子量1953

年英國劍橋大學SangerF.報告了牛胰島素兩條多肽鏈的氨基酸序列。三、蛋白質一級結構的測定第04章蛋白質的共價結構1、N-末端分析待分析的DNP-氨基酸可用紙層析、薄層層析或HPLC進行分離鑒定和定量測定DNP-NHAa1Aa2Aa3……AanDNFB+NH2Aa1Aa2Aa3……Aan弱堿pH8~9DNP-Aa1+Aa2+Aa3+……+AanH+水解（1）二硝基氟苯（DNFB或FDNB）N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(1)第04章蛋白質的共價結構2．丹磺酰氯（DNS）法是二甲氨基萘磺酰氯的簡稱。

原理：與DNFB相同

優(yōu)點：DNS具強烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，水解后直接可用紙電泳或薄層層析加以鑒定。N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(2)第04章蛋白質的共價結構（3）苯異硫氰酸酯（PITC）法N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(3)第04章蛋白質的共價結構（4）氨肽酶法性質：肽鏈外切酶（又稱：外切酶）。從多肽鏈的N-端逐個地向里切

常用的是：亮氨酸氨肽酶（LAP）

PITC+NH2-Aa1Aa2Aa3……AanPTC-NHAa1Aa2Aa3……Aan水解PTH-Aa1+Aa2Aa3……Aan待分析的氨基酸可用薄層層析、氣相色譜和HPLC進行鑒定此方法還可以用來測定氨基酸序列N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(4)第04章蛋白質的共價結構OOH2N-CH-C-NHNH2+…+H2N-CH-C-NHNH2+H2N-CH-COOHR1R（n-1）RnRnR(n-1)OH2N-CH-C-NH-…-C-NH-CH-C-NH-CH-R1無水NH2NH2100℃COOHOO2、C-末端分析（1）肼解法(n-1)

個氨基酸酰肼C-末端氨基酸N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(5)第04章蛋白質的共價結構（2）還原法：肽鏈C-末端氨基酸

↓硼氫化鋰

α－氨基醇

↓層析法（3）羧肽酶法：最常用的測C-末端殘基方法

性質：肽鏈外切酶，專一地從肽鏈的C端逐個降解，釋放出游離氨基酸。N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定(6)第04章蛋白質的共價結構二硫鍵的斷裂第04章蛋白質的共價結構

胰蛋白酶切割3次生成4個肽段溴化氰切割2次生成3個肽段

Glu為N-末端殘基氨基酸組成的分析多肽第04章蛋白質的共價結構待測定蛋白質作為抗原產(chǎn)生抗體多核糖體mRNAcDNA氨基酸序列mRNAProtein分離反轉錄測序推斷免疫處理破碎沉淀氨基酸序列（蛋白質）DNA序列（基因）用互補DNA法推斷蛋白質的氨基酸序列第04章蛋白質的共價結構

1

酶裂解法（1）胰蛋白酶專一性強、只斷裂賴氨酸、精氨酸的羧基參與形成的肽鍵（2）糜蛋白酶專一性不如胰蛋白酶，斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基所形成的肽鍵（3）嗜熱菌蛋白酶專一性差，斷裂較短的多肽鏈或大肽段（4）胃蛋白酶專一性與糜蛋白酶類似，要求被斷裂鍵兩側的殘基都是疏水性氨基酸（5）木瓜蛋白酶專一性差，斷裂位點與其附近的序列關系密切，它對Arg和Lys殘基的羧基端肽鍵敏感多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化第04章蛋白質的共價結構（1）用溴化氰斷裂化學裂解法(1)第04章蛋白質的共價結構（2）用羥胺斷裂（3）肽段的分離提純凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC化學裂解法(2)第04章蛋白質的共價結構1.Edman

化學降解法第一步偶聯(lián)反應第二步環(huán)斷裂反應第三步轉化反應肽段氨基酸序列的測定第04章蛋白質的共價結構借助重疊肽確定肽段在原多肽鏈中的次序肽段在多肽鏈中次序的決定第04章蛋白質的共價結構牛胰島素A鏈B鏈核糖核酸酶A序列蛋白質序列舉例第04章蛋白質的共價結構根據(jù)細胞色素c序列的物種差異建立的進化樹四、蛋白質的氨基酸序列與生物功能第04章蛋白質的共價結構肽液相合成X常用芐氧甲?；鵜常用叔丁酯肽鏈延伸方向激活參與肽鍵形成的羧基，現(xiàn)多用更溫和的疊氮、混合酸酐和活化酯法。五、肽和蛋白質的人工合成第04章蛋白質的共價結構H2N掛接去保護縮合釋放活化保護肽液相合成第04章蛋白質的共價結構小結（1）蛋白質分子是由一條或多條多肽鏈構成的生物大分子。多肽鏈是由氨基酸通過共價鍵共價連接而成的，各種多肽鏈都有自己特定的氨基酸序列。蛋白質的生物功能決定于它的高級結構，高級結構是由一級結構即氨基酸序列決定的，而氨基酸序列是由遺傳物質DNA的核苷酸序列規(guī)定的。肽鍵是連接多肽鏈主鏈中氨基酸殘基的共價鍵，二硫鍵是使多肽鏈之間交聯(lián)或使多肽鏈內成環(huán)的共價鍵測定蛋白質一級結構的策略

（1）測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目

（2）拆分蛋白質分子的多肽鏈

（3）斷裂多肽鏈內的二硫橋

（4）分析每一多肽鏈的氨基酸組成

（5）分析多肽鏈的N-末端和C-末端殘基（6）多肽鏈斷裂成肽段（7）測定各個肽段的氨基酸序列（8）重建完整多肽鏈的一級結構（9）確定半胱氨基酸殘基間形成的S－S交聯(lián)橋的位置第04章蛋白質的共價結構小結（2）序列分析中的重要方法和技術有：測定N-末端基的苯異硫氰酸酯（PITC