海洋微生物非常全

海洋微生物非常全第1頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月主要內(nèi)容一、海洋微生物的概述二、未培養(yǎng)微生物的研究三、海洋微生物培養(yǎng)的新方法

四、前景展望第2頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月概述

人類生存在一個(gè)被海洋覆蓋的星球，海洋占地球表面的70%以上，海洋中的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌及病毒等，提供了地球近一半的初級(jí)生產(chǎn)力，影響氣候變化，參與物質(zhì)和能量循環(huán)等。海洋環(huán)境具有高鹽、高壓、低溫、缺氧等特點(diǎn)，海洋微生物形成了有別于陸生生物的獨(dú)特新陳代謝途徑、生存繁殖方式、適應(yīng)機(jī)制,從而代謝產(chǎn)生結(jié)構(gòu)獨(dú)特的、具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。第3頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月概述

在過(guò)去的幾時(shí)年間，從陸生微生物中發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)（如新型抗生素）的速度越來(lái)越慢，人們?cè)絹?lái)越多的把目光集中在海洋微生物上（例如海洋放線菌、粘細(xì)菌等），希望從中發(fā)現(xiàn)新型生物活性分子。海洋微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物化合物具有高度的化學(xué)多樣性(結(jié)構(gòu)類型包括生物堿、聚酮、萜類、大環(huán)內(nèi)脂、肽類、脂肪酸、酰胺等)和生物活性多樣性(包括抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種活性)。

第4頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月特性

與陸地相比，海洋環(huán)境以高鹽、高壓、低溫和稀營(yíng)養(yǎng)為特征。海洋微生物長(zhǎng)期適應(yīng)復(fù)雜的海洋環(huán)境而生存，因而有其獨(dú)具的特性。1.嗜鹽性

2.嗜壓性3.嗜冷性

第5頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.低營(yíng)養(yǎng)性5.趨化性與附著生長(zhǎng)6.多形性7.發(fā)光性

特性第6頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月研究進(jìn)展

海洋微生物包括可培養(yǎng)微生物和未可培養(yǎng)微生物,對(duì)于可培養(yǎng)微生物的研究在很早就已經(jīng)開(kāi)展。然而海洋微生物中絕大多數(shù)還是未可培養(yǎng)微生物,對(duì)于海洋未可培養(yǎng)微生物的研究才剛剛展開(kāi),如何快速大量地分離、培養(yǎng)和鑒定海洋生態(tài)系統(tǒng)中的微生物，成了深入研究海洋微生物及大規(guī)模從海洋微生物中篩選生物活性物質(zhì)的瓶頸。第7頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因

基于16SrDNA序列分析的研究方法顯示，海洋中的絕大多數(shù)微生物都未獲得純培養(yǎng)。Kogure等用直接活菌鏡檢計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)海水中90%以上的細(xì)菌都是活的，但是在培養(yǎng)基平板上卻僅有少數(shù)的細(xì)菌（0.01-0.1%）能形成可見(jiàn)的菌落。大多數(shù)海洋微生物不能獲得純培養(yǎng)的原因可能是多方面的。第8頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因1.1實(shí)驗(yàn)室的純培養(yǎng)破壞了微生物細(xì)胞之間的交流許多海洋微生物與其他海洋生物/微生物處于共生狀態(tài)，或其生長(zhǎng)受周圍其他海洋生物/微生物代謝產(chǎn)物以及一些其它生長(zhǎng)因子的影響，離開(kāi)原生態(tài)環(huán)境則難以生長(zhǎng)。例如：鐵是所有微生物的一種必需元素，而實(shí)際上海水中的鐵濃度非常低(＜0.4μM)，并且只有極少數(shù)海洋細(xì)菌能夠產(chǎn)生從環(huán)境中獲取鐵的鐵載體（siderophores），這是一種小分子量鐵螯合化合物。第9頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)向含低濃度鐵（含0.1μMFe(III)）的培養(yǎng)基中加入外源的鐵載體和C8-HSL(辛?；呓z氨酸環(huán)內(nèi)酯)時(shí)，原本在低濃度鐵培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的海洋細(xì)菌也能形成菌落。這說(shuō)明本身不能產(chǎn)生鐵載體的海洋細(xì)菌在其他能產(chǎn)生鐵載體的細(xì)菌存在的情況下也能從環(huán)境中獲取鐵，這是微生物之間的一種共生關(guān)系。第10頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因另外，在饑餓狀態(tài)下大多數(shù)微生物基因表達(dá)所涉及的cAMP、與大多數(shù)革蘭氏陰性菌的密度感應(yīng)系統(tǒng)(quorumsensing)密切相關(guān)的酰基高絲氨酸內(nèi)酯(HSLs)分子等都可能是細(xì)胞之間溝通的信號(hào)分子。實(shí)驗(yàn)室對(duì)海洋微生物的純培養(yǎng)破壞了微生物之間的這種共生狀態(tài)，微生物之間的信息交流被阻斷，生長(zhǎng)必需的信號(hào)分子和生長(zhǎng)因子缺乏，如許多海洋細(xì)菌離不開(kāi)藻類分泌的生長(zhǎng)因子和維生素，所以表現(xiàn)為不可培養(yǎng)。第11頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因1.2培養(yǎng)條件與原生態(tài)環(huán)境差別太大由于自然界中微生物數(shù)量龐大，其可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極其匱乏，多數(shù)處于“寡營(yíng)養(yǎng)”狀態(tài)。常規(guī)的微生物培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于微生物生長(zhǎng)的自然環(huán)境，高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能比較適合于那些生長(zhǎng)速度快且對(duì)高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有抵抗能力的微生物，但是對(duì)那些生長(zhǎng)速度較慢的微生物可能有抑制作用，甚至?xí)霈F(xiàn)底物加速死亡(Substrateaccelerateddeath)現(xiàn)象。第12頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)無(wú)法完全模擬海洋環(huán)境，而生存環(huán)境的巨大改變往往導(dǎo)致微生物不可培養(yǎng)。(1)在海洋中，微生物處于開(kāi)放、流通的大環(huán)境，但在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)，微生物只能在恒溫、恒濕的條件下生長(zhǎng)。(2)實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法是平板培養(yǎng)或液體震蕩培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式與海洋微生物原始的生活環(huán)境差距太大，也會(huì)導(dǎo)致微生物的不生長(zhǎng)。(3)目前微生物的培養(yǎng)基只有有限的幾種營(yíng)養(yǎng)成分，不能提供微生物生長(zhǎng)繁殖的一些必須的元素物質(zhì)。第13頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因1.3氧化脅迫引起細(xì)胞損傷當(dāng)海洋中的微生物從自然環(huán)境突然轉(zhuǎn)入人為環(huán)境時(shí)，一些對(duì)新環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)或生長(zhǎng)較快的微生物很快形成肉眼可見(jiàn)的菌落，這些生長(zhǎng)快的微生物會(huì)產(chǎn)生大量過(guò)氧化物、自由基和超氧化物，這些物質(zhì)的存在使那些適應(yīng)能力較差或生長(zhǎng)較慢的微生物細(xì)胞受到損傷，從而不能生長(zhǎng)。第14頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因1.4生長(zhǎng)緩慢的微生物被忽視當(dāng)把微生物從原始的生態(tài)環(huán)境中突然轉(zhuǎn)入人為的環(huán)境時(shí)，適合生長(zhǎng)的微生物占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位,它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的大量攝取使生長(zhǎng)緩慢的微生物得不到充足的營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)受到限制。在培養(yǎng)基平板上，一個(gè)菌落中細(xì)胞的數(shù)目至少為105個(gè)才能用肉眼觀察到，而那些生長(zhǎng)速度較慢、其生長(zhǎng)達(dá)不到高密度的細(xì)菌種類，在培養(yǎng)基上用肉眼是看不到菌落的，從而導(dǎo)致這些微生物的生長(zhǎng)不被發(fā)覺(jué)，表現(xiàn)為“不可培養(yǎng)”。第15頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、海洋微生物難培養(yǎng)的原因1.5活的非可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)細(xì)菌的存在細(xì)菌的VBNC狀態(tài)，是指某些細(xì)菌處于不良環(huán)境條件下，其整個(gè)細(xì)胞?？s小成球形，用常規(guī)培養(yǎng)基在常規(guī)條件下培養(yǎng)時(shí)不能使其繁殖，但它們?nèi)匀痪哂写x活性。這時(shí)細(xì)菌呈休眠狀態(tài)，是細(xì)菌的一種特殊存活形式。第16頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、對(duì)未培養(yǎng)微生物的研究

由于上述的種種原因，大多數(shù)海洋微生物尚未被培養(yǎng)。目前，對(duì)不能進(jìn)行純培養(yǎng)的微生物的主要研究是依賴分子生物學(xué)手段，不需要對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，直接提取微生物基因組，通過(guò)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等手段來(lái)了解未培養(yǎng)微生物的代謝途徑、基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制等信息。第17頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

基于16SrDNA基因分析的方法在研究環(huán)境中的分類單元和物種時(shí)起了很大的作用。但所能提供的信息量也是很有限的。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的宏基因組學(xué)，利用分子生物學(xué)的研究方法繞過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)來(lái)研究微生物的多樣性及功能，提供了一種探知微生物多樣性結(jié)構(gòu)和功能基因組的免培方法，是一條尋找新基因及其產(chǎn)物的新途徑。第18頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月宏基因組技術(shù)在開(kāi)發(fā)未

培養(yǎng)微生物中的應(yīng)用1998年，ARIDAPharmaceuticals公司的科學(xué)家Handelsman等首次提出宏基因組(thegenomesofthetotalmicrobiotafoundinnature)的概念。宏基因組是指某一特定的環(huán)境中全部微生物（可培養(yǎng)的和未培養(yǎng)）基因的總和。宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系等為研究目的的新的微生物研究方法，也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)或生態(tài)基因組學(xué)。第19頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月宏基因組學(xué)技術(shù)流程1、從環(huán)境中提取宏基因組DNA；2、用核酸內(nèi)切酶切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段并連接到合適的載體上；3、轉(zhuǎn)化宿主菌，形成一個(gè)重組的DNA文庫(kù)即宏基因組文庫(kù)；4、宏基因組文庫(kù)篩選。第20頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、環(huán)境樣品DNA提取提取步驟通常需要滿足兩個(gè)條件：①盡可能提取樣品所有微生物的基因，②保持片段的完整和純度。第21頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、環(huán)境樣品DNA提取

樣品提取方法物理法：凍融法、超聲法、玻璃球珠擊打法、液氮碾磨法

化學(xué)法：常用化學(xué)試劑有表面活性劑、鹽類、有機(jī)溶劑等

酶裂解法

依據(jù)提取樣品總DNA前是否分離細(xì)胞，又可以分為原位裂解法和異位裂解法。第22頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、環(huán)境樣品DNA提取1、原位裂解法（直接提取法）原位裂解法是在環(huán)境樣品中加入DNA提取緩沖液，使細(xì)胞裂解然后從樣品中直接提取DNA并純化的方法。

優(yōu)缺點(diǎn)：該法提取的DNA產(chǎn)量較高，操作容易、成本低，但純度低，腐植酸等污染嚴(yán)重，往往還需要經(jīng)過(guò)純化處理才能滿足后續(xù)分子生物學(xué)操作的需要，此外，由于機(jī)械剪切作用較強(qiáng)，提得的DNA片段長(zhǎng)度有限（1-50Kb），常適用于構(gòu)建小片段插人文庫(kù)(以質(zhì)粒和噬菌體為載體)的DNA提取。第23頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、環(huán)境樣品DNA提取

2、異位裂解法異位裂解法是先把微生物細(xì)胞從環(huán)境樣品中分離出來(lái)，再?gòu)奈⑸锛?xì)胞提取DNA并純化。優(yōu)缺點(diǎn)：所得的DNA純度較高，但DNA產(chǎn)量及所包含的基因組信息的廣泛性不及直接提取法并且操作繁瑣、成本高、得率低。間接提取法提得的DNA片段長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)（20-500Kb），適合構(gòu)建黏粒（cosmid）文庫(kù)和細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫(kù)。第24頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、宏基因組文庫(kù)構(gòu)建1、載體系統(tǒng)選擇常用的克隆載體有:質(zhì)粒載體(如pUC18和pUC19)，插入片段一般小于10kb；Cosmid(黏粒載體，如pWE15)，插入片段30～45kb；BAC(細(xì)菌人工染色體，如pBeloBAC11)，插入片段大于100kb。第25頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

1、選擇合適的載體系統(tǒng)，應(yīng)考慮以下因素:

所提DNA的質(zhì)量及研究目的，包括插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數(shù)、使用的宿主以及篩選方法等。如對(duì)腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，小片段的文庫(kù)適用于篩選新的與代謝相關(guān)的單基因或小操縱子。而對(duì)于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則適宜構(gòu)建Cosmid、Fosmid或BAC文庫(kù)，從而篩選由較大基因簇編碼的復(fù)雜代謝途徑或能夠表征環(huán)境中未培養(yǎng)微生物基因組的較大基因片段。二、宏基因組文庫(kù)構(gòu)建第26頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、宏基因組文庫(kù)構(gòu)建

2、宿主系統(tǒng)選擇宿主菌株的選擇主要考慮：轉(zhuǎn)化效率，重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性，宿主能否為相關(guān)功能基因提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物提供必需的轉(zhuǎn)錄表達(dá)體系，對(duì)異源表達(dá)基因產(chǎn)物是否有較強(qiáng)的相容性，以及目標(biāo)性狀(如抗菌性)及缺陷型等因素。研究表明，不同微生物種類所產(chǎn)生的活性物質(zhì)有明顯差異，不同的研究目標(biāo)應(yīng)選擇不同的宿主菌株。鑒于7O%的抗生素來(lái)源于放線菌的事實(shí)，若以尋找抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)為目標(biāo)，選擇鏈霉菌為宿主較理想；而篩選新的酶則采用大腸桿菌為宜。第27頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月二、宏基因組文庫(kù)構(gòu)建3、轉(zhuǎn)化在宏基因組克隆中，所謂轉(zhuǎn)化是指通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾拗骷?xì)胞處于感受態(tài)，從而攝取重組DNA的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程。其方法有CaC12法和電穿孔法。

CaC12法即用高濃度的Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞使其成為能攝取外源DNA的感受狀態(tài)，該方法自建立以來(lái)已廣泛用于以大腸桿菌為受體的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，但該方法轉(zhuǎn)化效率不高。電穿孔法是用高壓脈沖電流擊破宿主細(xì)胞膜或擊成小孔，從而使外源DNA由小孔進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率較高。第28頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、宏基因組文庫(kù)篩選1、功能驅(qū)動(dòng)的篩選2、化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選3、序列驅(qū)動(dòng)的篩選4、底物誘導(dǎo)的篩選第29頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1功能驅(qū)動(dòng)的篩選功能驅(qū)動(dòng)的篩選(Function-drivenscreening)即基于活性的篩選。是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性而進(jìn)行篩選的方法。優(yōu)點(diǎn)：只要基因能在宿主中表達(dá)，就可以根據(jù)基因表達(dá)特性進(jìn)行篩選，能迅速找到可用于工農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的酶等蛋白質(zhì)和抗生素等天然產(chǎn)物；缺點(diǎn)：目的基因必須能在宿主中進(jìn)行功能表達(dá)，而基因表達(dá)與否除了和宿主有關(guān)外，還決定于基因本身的完整性，這就要求一方面要選擇合適的宿主菌株，另一方面要求克隆到基因或基因簇的全長(zhǎng)，一旦克隆過(guò)程中基因的某個(gè)組件遭到破壞將使基因無(wú)法表達(dá)，也就不能根據(jù)表型加以篩選。篩選工作量大、效率低。第30頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選

化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選(Screeningoncompoundstructure)是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的吸收峰值，通過(guò)比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。這一方法可直接篩選到新結(jié)構(gòu)化合物，但不一定有生物活性，且工作量大、成本高。第31頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3序列驅(qū)動(dòng)的篩選序列驅(qū)動(dòng)的篩選(Sequence-drivenscreening)是根據(jù)已知功能的基因序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過(guò)核酸雜交或PCR擴(kuò)增來(lái)篩選具有目標(biāo)序列的克隆子。優(yōu)點(diǎn)：不依賴克隆基因在宿主菌株中的表達(dá)。缺點(diǎn)：必須對(duì)相關(guān)基因序列有所了解，無(wú)法篩選宏基因組文庫(kù)中那些和現(xiàn)有基因序列完全不同的新基因(即未知基因)。第32頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

通過(guò)基因芯片技術(shù)尋找環(huán)境基因組序列中的有用片段也是一種全新的篩選技術(shù)，它可以快速有效的識(shí)別和描述許多菌落的特征，并可應(yīng)用于大量保守基因的分離?；谛蛄械暮Y選策略可以利用基因芯片技術(shù)大大提高篩選效率，有可能篩選到某一類結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)中的新分子，但必須對(duì)相關(guān)基因序列有一定的了解，較難發(fā)現(xiàn)全新的活性物質(zhì)。第33頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4底物誘導(dǎo)的篩選底物誘導(dǎo)的篩選(Substrate-inducedgeneexpressionscreening，SIGEX)是利用合適的底物進(jìn)行誘導(dǎo)，使克隆子分解代謝基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行篩選的方法。優(yōu)點(diǎn)：為高通量篩選提供了保障，而且不需要對(duì)底物進(jìn)行修飾；可以從底物推斷出未知的酶，進(jìn)而推斷基因的功能;

第34頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月缺點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)性和適應(yīng)性很敏感，用于誘導(dǎo)的底物必須要進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，若不能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，則無(wú)法誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；但是某些基因的表達(dá)不僅受底物誘導(dǎo)，還可受其他因子的誘導(dǎo)；某些基因無(wú)需誘導(dǎo)即能表達(dá)；某些本可誘導(dǎo)表達(dá)的基因由于宿主的改變而無(wú)法誘導(dǎo)表達(dá)。而且對(duì)進(jìn)樣設(shè)備的要求也比較高。第35頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

盡管應(yīng)用分子生物學(xué)和非培養(yǎng)手段分析環(huán)境中的海洋微生物基因組能夠獲得大量的信息，避免了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的一些局限性，但是要了解基因組中某些基因表達(dá)產(chǎn)物的代謝途徑，對(duì)海洋細(xì)菌的一些深入的生理學(xué)研究以及相關(guān)的生物技術(shù)的發(fā)展還將有賴于微生物的培養(yǎng)與純化。

第36頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

另外，人口數(shù)量的增加、漁業(yè)的過(guò)度開(kāi)發(fā)、氣候變化和環(huán)境污染等因素，也使自然界中的很多微生物種類逐漸消失，對(duì)環(huán)境中微生物進(jìn)行培養(yǎng)、純化并保種，建立微生物菌種庫(kù)，可以使大量的微生物資源得以保存，對(duì)于微生物資源的保護(hù)、利用和研究開(kāi)發(fā)具有非常重大的意義。第37頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月近年發(fā)展的海洋微生物培養(yǎng)新方法

海洋微生物學(xué)家越來(lái)越認(rèn)識(shí)到，經(jīng)典的平板培養(yǎng)方法不適合于海洋微生物的培養(yǎng)。近年來(lái)，一些研究者開(kāi)始嘗試新的培養(yǎng)方法來(lái)增加可培養(yǎng)細(xì)菌的種類，這些新方法多采用稀釋的培養(yǎng)基或模擬自然環(huán)境直接用無(wú)菌海水進(jìn)行培養(yǎng)。第38頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.1向培養(yǎng)基中添加微生物生長(zhǎng)所必需的成分在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號(hào)分子(?；呓z氨酸內(nèi)酯、cAMP或ATP等)就可簡(jiǎn)單地模擬微生物間的相互作用,滿足微生物生長(zhǎng)繁殖的要求。其中與革蘭氏陰性菌多種基因調(diào)控有關(guān)的cAMP是最有效的信號(hào)分子，10μMcAMP可使10%的微生物細(xì)胞（用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)算微生物細(xì)胞的總數(shù)）培養(yǎng)出來(lái)。然而，用加有cAMP的培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌如果不繼續(xù)添加信號(hào)分子，則不能生長(zhǎng)。Kashefi等根據(jù)嗜高熱微生物利用Fe(III)作為終端電子受體這一高度保守的特性,在培養(yǎng)基中添加非常微量的Fe(III)氧化物,能提高嗜高熱微生物的可培養(yǎng)性。第39頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.2降低培養(yǎng)過(guò)程中的毒害作用為了降低培養(yǎng)過(guò)程中優(yōu)勢(shì)菌種代謝所產(chǎn)生的過(guò)氧化物、自由基和一些拮抗物質(zhì)的毒害作用，可以在培養(yǎng)基中添加對(duì)這些毒性成分具有降解能力的物質(zhì)，如丙酮酸鈉、甜菜堿、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶等。SOD和丙酮酸鈉的代謝產(chǎn)物NADH、H+可與超氧化物結(jié)合，從而降低了超氧化物對(duì)細(xì)胞的損害作用。甜菜堿（三甲氨基乙內(nèi)酯）的三個(gè)甲基中有兩個(gè)可以被超氧化物或自由基氧化，也可以降低超氧化物或自由基對(duì)細(xì)胞的毒害作用。過(guò)氧化氫酶通過(guò)對(duì)過(guò)氧化物的水解，減少了過(guò)氧化物對(duì)微生物的毒害作用。同時(shí),充足的氧氣有時(shí)也是毒性氧產(chǎn)生的原因之一,減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓也可減弱毒性氧的影響。第40頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3.3稀釋培養(yǎng)法海洋微生物目前獲得純培養(yǎng)的不到1%，這是由于海洋環(huán)境中主要是寡營(yíng)養(yǎng)微生物，而在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于微生物生長(zhǎng)的自然環(huán)境。高濃度的營(yíng)養(yǎng)可能對(duì)寡營(yíng)養(yǎng)微生物具有抑制作用。第41頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1993年，Button等提出一個(gè)嶄新的方法，即稀釋培養(yǎng)法（Dilutionculture），來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。Button等先將海洋微生物群落計(jì)數(shù)后再進(jìn)行稀釋，然后接種于滅菌海水中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)九周后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)微生物細(xì)胞的濃度可達(dá)到104個(gè)/ml，細(xì)胞的倍增時(shí)間為一天到一周。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加刺激了某些微生物的生長(zhǎng)，但是卻抑制了大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)。Schut等應(yīng)用稀釋培養(yǎng)法在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下也培養(yǎng)出了典型海洋細(xì)菌。將常規(guī)微生物培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使?fàn)I養(yǎng)物濃度降低，也能增加可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。第42頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.4高通量培養(yǎng)法2002年，Connon等提出了高通量培養(yǎng)法（High-throughputculturing）。他們將樣品濃度稀釋至103個(gè)/ml后，采用48孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離培養(yǎng)微生物。通過(guò)這種方法可培養(yǎng)出高于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)所培養(yǎng)的微生物數(shù)量。第43頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.5擴(kuò)散盒培養(yǎng)法這種培養(yǎng)方法是模擬海洋微生物生長(zhǎng)的自然環(huán)境。Kaeberlein等設(shè)計(jì)了一種培養(yǎng)裝置名為擴(kuò)散盒（diffusionchamber）。該擴(kuò)散盒由一個(gè)環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連的0.1μm濾膜組成。將海洋微生物樣品加至封閉的擴(kuò)散盒中，在模擬采樣點(diǎn)環(huán)境條件的玻璃缸中進(jìn)行培養(yǎng)。擴(kuò)散盒的膜可使化學(xué)物質(zhì)在盒內(nèi)和環(huán)境之間進(jìn)行交換，但是細(xì)胞卻不能自由移動(dòng)。這種培養(yǎng)方法能較大程度地模擬微生物所處的自然環(huán)境，由于化學(xué)物質(zhì)可以自由穿過(guò)薄膜，可保證微生物群落間作用的存在，從而提高了微生物的可培養(yǎng)性。第44頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.6微囊包埋法微囊包埋法是海洋微生物的另一種高通量分離培養(yǎng)技術(shù)。先將海水和土壤樣品中的微生物進(jìn)行稀釋培養(yǎng)，然后將稀釋到一定濃度的菌液與融化的瓊脂糖混合，制成包埋單個(gè)微生物細(xì)胞的瓊脂糖微囊，然后將微囊裝入凝膠柱內(nèi)，用培養(yǎng)液進(jìn)行流動(dòng)培養(yǎng)。凝膠柱進(jìn)口端用0.1μm濾膜封住，防止細(xì)菌的進(jìn)入而污染凝膠柱；出口端用8μm濾膜封住，防止微囊隨培養(yǎng)液流出。該技術(shù)將瓊脂糖包埋培養(yǎng)與流式細(xì)胞儀篩選結(jié)合起來(lái)，這樣就可以增加細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度，縮短低生長(zhǎng)率細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間。第45頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是：①盡管每個(gè)細(xì)胞被單獨(dú)包埋，但是來(lái)自環(huán)境的所有被包埋的細(xì)胞都在一起培養(yǎng)，這在一定程度上模擬了自然環(huán)境，而且由于微囊的孔徑較大，代謝產(chǎn)物和一些其他分子(如信號(hào)分子)可以互相交換，這些由其他微生物產(chǎn)生的可以擴(kuò)散的分子可以增加微生物的可培養(yǎng)性。②微囊是在一個(gè)開(kāi)放的、連續(xù)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的系統(tǒng)中，而不是在一個(gè)封閉的系統(tǒng)中，這也模擬了大多數(shù)自然環(huán)境的開(kāi)放條件。第46頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③這種培養(yǎng)方法不僅能夠高通量的分離和培養(yǎng)微生物，而且能夠很容易的進(jìn)行下游的擴(kuò)大培養(yǎng)。長(zhǎng)出的微菌落可用于接種，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。④該分離培養(yǎng)技術(shù)可使大量的微生物獲得純培養(yǎng)。

第47頁(yè)，課件共52頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.7針對(duì)放線菌的培養(yǎng)法Gavrish等根據(jù)放線菌獨(dú)特的長(zhǎng)菌絲以及能穿透固體培養(yǎng)基的特性提出了一種專門(mén)篩選放線菌的新方法。將兩片具有半透性的膜分別上下封在中間裝有滅菌瓊脂的塑料容器上，下層膜的孔徑是0.2-0.6μm,上層膜的孔徑是0.03μm，將裝置置于土壤中，細(xì)絲狀的微生物就會(huì)選擇性的刺入裝置并長(zhǎng)成菌落。將