乙型腦炎病毒減毒疫苗株sa14-14-2囊膜蛋白氨基酸回復(fù)突變株的構(gòu)建及其對(duì)疫苗安全性的影響

乙型腦炎病毒減毒疫苗株sa14-14-2囊膜蛋白氨基酸回復(fù)突變株的構(gòu)建及其對(duì)疫苗安全性的影響

急性乙腦病毒（hcl），日本腦炎病毒（jv），是黃色病毒科黃病毒屬的成員。這是一種害蟲病毒。主要的傳播媒體是三對(duì)胰腸。它的遺傳媒體是一個(gè)四相狀的個(gè)體。它含有約1000顆糖，三種結(jié)構(gòu)蛋白（c、prm和e）和七種非結(jié)構(gòu)蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5）。由于接種減毒活疫苗可以模擬病毒的自然感染過(guò)程,1針免疫即可引起強(qiáng)有力的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并且免疫力持久甚至可以起到終身保護(hù)的作用,具有更大的經(jīng)濟(jì)和性能優(yōu)勢(shì)。乙腦減毒活疫苗(SA14-14-2株)自1989年獲批生產(chǎn)以來(lái),不但用于國(guó)內(nèi)兒童乙腦疾病的預(yù)防,而且還出口多個(gè)國(guó)家。2013年由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的乙腦疫苗通過(guò)了WHO預(yù)認(rèn)證,全球使用量達(dá)6億劑以上,未發(fā)生任何嚴(yán)重不良反應(yīng)的報(bào)道1材料和方法1.1病毒疫苗一室提供乙腦減毒疫苗株SA14-14-2由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司(簡(jiǎn)稱成都公司)病毒疫苗一室提供;乙腦野毒株SA14由成都公司病毒疫苗研究室提供。1.2細(xì)胞幼小倉(cāng)鼠腎(BHK21)細(xì)胞由成都公司病毒疫苗研究室提供;原代地鼠腎(PHK)細(xì)胞由成都公司病毒疫苗一室提供。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17~19日齡無(wú)特殊病原體級(jí)(SPF級(jí))昆明種小鼠由成都公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.4轉(zhuǎn)錄試劑及儀器限制內(nèi)切酶KasI、BglII、XhoI,T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB(北京)有限公司;體外轉(zhuǎn)錄試劑盒Ribo-MAXLargeScaleRNAProductionSystem購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。MastercyclerPro梯度PCR儀購(gòu)自Eppendorf(艾本德)中國(guó)有限公司;GenepulserⅡ電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。1.5rjev264的構(gòu)建和鑒定1.5.1-14-2和pacnr-3,apos的構(gòu)建rJEV264的構(gòu)建采用雙質(zhì)粒系統(tǒng),將SA14-14-2基因組的5'端序列(1~3446核苷酸)和3'端序列(3446~10976核苷酸)分別插入到質(zhì)粒載體pACNR,構(gòu)建成SA14-14-2的兩個(gè)半分子克隆,分別命名為pACNR-5'JEV和pACNR-3'JEV擴(kuò)增步驟如下:首先用引物F1、R2擴(kuò)增片段A,再用引物F2、R1擴(kuò)增片段B,然后以片段A和B為模板,以F1和R1為引物擴(kuò)增含E264位點(diǎn)回復(fù)突變的片段C,用限制內(nèi)切酶KasI和BglII酶切后插入到半分子克隆質(zhì)粒pACNR-5'JEV中,構(gòu)建成含有E264位點(diǎn)突變的JEV5'半分子克隆質(zhì)粒p5'E-M264。最后將含有E264位點(diǎn)突變的JEV片段(1~3446)插入到pACNR-3'JEV質(zhì)粒中,構(gòu)建成含E264位點(diǎn)回復(fù)突變的JEV全長(zhǎng)克隆質(zhì)粒,測(cè)序驗(yàn)證全長(zhǎng)克隆插入序列的正確性。1.5.2拯救病毒的病毒模型用限制內(nèi)切酶XhoI酶切線性化上述全長(zhǎng)質(zhì)粒,體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性的RNA轉(zhuǎn)錄體,通過(guò)電擊轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,大約4d后,待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變特征(cytopathiceffect,CPE),收獲上清,即為拯救的病毒。提取病毒RNA進(jìn)行RT-PCR,測(cè)序驗(yàn)證回復(fù)病毒。1.6rjev264的雕刻形態(tài)特征和形態(tài)分配1.6.1刻蝕的形態(tài)特征用含2%滅能新生牛血清的MEM維持液做10倍系列稀釋至101.6.2體外取樣方法按照接種量MOI=0.001分別將rJEV264和SA14-14-2接種到長(zhǎng)滿單層PHK細(xì)胞的細(xì)胞瓶中,每隔24h取樣1次,連續(xù)取樣至120h。按照上述1.6.1項(xiàng)方法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)樣品的滴度并繪制一步生長(zhǎng)曲線,分析E264位點(diǎn)回復(fù)突變后在PHK21細(xì)胞上增殖特征的變化。1.7大鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵蝕的測(cè)定1.7.1腦內(nèi)神經(jīng)毒癥為測(cè)定rJEV264的小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力,將rJEV264做10倍系列稀釋(101.7.2動(dòng)物死亡率檢測(cè)為測(cè)定rJEV264的神經(jīng)侵襲力,分別采用0.1mL/只皮下注射(s.c.)、0.5mL/只腹腔注射(i.p.)17~19日齡SPF級(jí)昆明種小鼠,以SA14-14-2為對(duì)照,每組6只,觀察14d,計(jì)算小鼠死亡率。1.8統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1rjev264全球龍的構(gòu)建和病毒救助2.1.1質(zhì)粒大小對(duì)比瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,rJEV264全長(zhǎng)克隆質(zhì)粒大小為13.5kb,和預(yù)期相同,見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果顯示,構(gòu)建的E264全長(zhǎng)克隆除引入的E264突變位點(diǎn)外,其余序列與SA14-14-2完全一致。2.1.2變特征及變特征模型轉(zhuǎn)染后4d,BHK21細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變特征,見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果顯示,拯救出的病毒E264位點(diǎn)存在預(yù)期的回復(fù)突變,全基因組序列與全長(zhǎng)克隆完全相同,沒(méi)有發(fā)生新的位點(diǎn)突變,見(jiàn)圖3。2.2rjev264雕刻特征和生殖特征2.2.1雕刻屬性rJEV264蝕斑大小和SA14-14-2基本相同,沒(méi)有明顯差異,兩者均明顯小于SA14,見(jiàn)圖4。2.3大鼠腦內(nèi)的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵略力2.3.1鼠患者典型麻黃性患者腦內(nèi)注射小鼠7d后,rJEV264組小鼠出現(xiàn)典型的腦炎特征,平均存活天數(shù)8.2d。主要表現(xiàn)為萎靡、厭食、毛聳、下肢癱瘓,病毒腦內(nèi)神經(jīng)毒力為5.51lgPFU/LD2.3.2rjev214對(duì)小鼠發(fā)病或死亡的影響結(jié)果顯示,無(wú)論是皮下注射,還是腹腔注射,觀察期內(nèi)rJEV264組小鼠和SA14-14-2對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)小鼠發(fā)病或死亡情況,見(jiàn)表3。3e64位點(diǎn)回復(fù)突變對(duì)小鼠神經(jīng)毒力的影響反向遺傳學(xué)技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)是研究病毒致病機(jī)制或免疫分子基礎(chǔ)的主要手段。在本研究中,SA14-14-2E264位點(diǎn)的回復(fù)突變可使病毒的小鼠腦內(nèi)致病力顯著增強(qiáng)。但是,蝕斑形態(tài)和一步生長(zhǎng)曲線顯示,rJEV264和SA14-14-2均沒(méi)有顯著區(qū)別,表明該位點(diǎn)的回復(fù)突變沒(méi)有改變病毒的增殖能力,腦內(nèi)神經(jīng)毒毒力增強(qiáng)可能是由于E264位點(diǎn)的回復(fù)突變?cè)鰪?qiáng)了病毒與宿主細(xì)胞的吸附或融合能力。E264位點(diǎn)的回復(fù)突變雖然可以導(dǎo)致其小鼠腦內(nèi)神經(jīng)毒力的增強(qiáng),但是無(wú)論是皮下注射還是腹腔注射,小鼠均未發(fā)病,表明該位點(diǎn)的回復(fù)突變并沒(méi)有增強(qiáng)其對(duì)小鼠的神經(jīng)侵襲力。研究表明,無(wú)論是在原代地鼠腎(PHK)細(xì)胞,還是在乳鼠腦內(nèi)傳代20次后,該位點(diǎn)均未發(fā)生回復(fù)突變ARROYO等前期研究發(fā)現(xiàn),E264位點(diǎn)回復(fù)突變會(huì)顯著降低JEV的免疫原性在對(duì)SA14-14-2E蛋白的其他5個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)(E107、E138、E176、E177、E279)的研究中發(fā)現(xiàn),E138和E107位點(diǎn)的回復(fù)突變能顯著提高病毒小鼠的神經(jīng)毒力,是影響乙腦病毒神經(jīng)毒力最關(guān)鍵的兩個(gè)位點(diǎn),并且兩個(gè)位點(diǎn)之間有很強(qiáng)的協(xié)同作用遺傳穩(wěn)定性是減毒活疫苗最重要的檢測(cè)項(xiàng)目之一,而對(duì)疫苗株減毒機(jī)制的深入研究是開(kāi)展遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)的前提。本研究從分子水平上證明了E264位點(diǎn)對(duì)乙腦減毒活疫苗安全的重要性,為乙腦減毒活疫苗的質(zhì)量控制和遺傳穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了實(shí)驗(yàn)