桑葉提取物抗抑郁作用及其機(jī)制研究

桑葉提取物抗抑郁作用及其機(jī)制研究

抑郁是精神障礙的主要類型。它具有高度的發(fā)病率和高度的自殺率，對(duì)社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。2005～2015年，抑郁癥患者的總數(shù)增加了18.4%。2015年，世界衛(wèi)生組織將抑郁癥列為造成全球非致命健康損失的首要因素。此外，抑郁癥是自殺死亡的主要原因中醫(yī)將抑郁癥歸于郁證范疇，認(rèn)為郁證主要因七情所傷、情志不遂、肝氣郁結(jié)或氣郁化火、郁火傷肝而為病，故病位主要在肝，疏肝解郁是重要治法之一中國桑樹資源豐富，桑樹中黃酮類成分含量較高，含量高達(dá)55.38mg/g1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件雄性BALB/c小鼠，SPF級(jí)、體質(zhì)量18～22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，每日6∶30～18∶30日光燈照明，自由攝食飲水，用生長維持顆粒飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程遵循本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。1.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器EML（批號(hào)：T20181025，黃酮含量41.2%），由湖南希爾天然藥業(yè)有限公司提供；取干燥的桑葉凈料，加5～10倍量的水提取2次，每次1h，合并前2次提取藥液，經(jīng)冷卻至40～50℃后上D-101型大孔樹脂柱，依次用水、65%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，經(jīng)回收乙醇后減壓濃縮得稠膏，將稠膏采取噴霧干燥即得總黃酮部位EML；取蘆丁作對(duì)照品（分光光度法測定EML中的黃酮含量為41.2%）。鹽酸度洛西汀（duloxetine,DLX，批號(hào)：1304002），上海萬代制藥有限公司。5-羥色氨酸（5-hydroxy-L-tryptophan,5-HTP；批號(hào)：H9772）、育亨賓（yohimbine，批號(hào)：Y3125）和利血平（reserpine，批號(hào)：WXBC7476V），均購于美國Sigma公司。開場箱：自制，由底面為80cm×80cm、高50cm四壁光滑的不透明塑料板制成，底面被劃分成為16個(gè)20cm×20cm的等邊方格；小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)箱：自制（20cm×25cm×30cm）；小鼠強(qiáng)迫游泳缸：2L大燒杯；TH-212智能數(shù)字測溫儀，北京海創(chuàng)高科技有限公司。1.3動(dòng)物單次給藥和小鼠自發(fā)活動(dòng)檢測實(shí)驗(yàn)分組：50只BALB/c小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組（VEH）、陽性藥組（DLX,20mg/kg）、EML100、200和400mg/kg組，每組10只。各組按10ml/kg給藥體積灌胃（ig），末次給藥1h后分別進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，其中DLX單次給藥后進(jìn)行測試，EML連續(xù)給藥7d進(jìn)行測試。小鼠自發(fā)活動(dòng)檢測：將小鼠置開場箱一角中心方格內(nèi)，頭朝壁放入，觀察5min內(nèi)小鼠的穿格次數(shù)和直立次數(shù)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用30%乙醇清潔開場箱以清除對(duì)下一只動(dòng)物的影響。小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)：參照Steru等小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：參照Porsolt等1.4單次給藥和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)50只BALB/c小鼠分組同1.3。適應(yīng)性喂養(yǎng)5d后各組按10ml/kg給藥體積灌胃給藥，各組單次給藥1h后分別進(jìn)行自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，方法同1.3。1.5關(guān)于異殘抗抑郁作用的初步研究1.5.1小鼠扭頭次數(shù)的檢測50只BALB/c小鼠分組同1.3。單次ig給藥1h后腹腔注射（ip）給予5-HTP120mg/kg，立即開始觀察，記錄20min內(nèi)小鼠甩頭次數(shù)1.5.2大鼠育種中的毒毒癥實(shí)驗(yàn)50只BALB/c小鼠分組同1.3。單次ig給藥1h后皮下注射（sc）給予育亨賓30mg/kg，觀察記錄24h內(nèi)各組動(dòng)物死亡數(shù)1.5.3評(píng)估小鼠前眼溫60只BALB/c小鼠除增加模型組（10只）外，其余分組同1.3。溶劑對(duì)照組和模型組小鼠ig給予滅菌注射用水，陽性藥組、EML低、中、高劑量組分別ig給予DLX20mg/kg、EML100、200和400mg/kg，給藥體積10ml/kg。給藥后1h，溶劑對(duì)照組ip給予生理鹽水，其余各組均ip給予利血平2.5mg/kg，分別記錄以下指標(biāo)：眼瞼下垂評(píng)分、肛溫變化和運(yùn)動(dòng)不能的只數(shù)眼瞼下垂評(píng)分：給予利血平后1h，按小鼠眼瞼閉合程度打分：完全睜開0分，1/4閉合1分，1/2閉合2分，3/4閉合3分，完全閉合4分，統(tǒng)計(jì)各組平均得分。肛溫變化：分別于各組給藥前（T運(yùn)動(dòng)不能測試：給予利血平后1h，將小鼠置于直徑7.5cm的圓圈中央進(jìn)行觀察，15s內(nèi)不能走出圓圈記為“運(yùn)動(dòng)不能”，記錄各組運(yùn)動(dòng)不能小鼠只數(shù)。1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料據(jù)（利血平拮抗實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)不能動(dòng)物數(shù)和育亨賓毒性實(shí)驗(yàn)的死亡率）采用精確Fisherexact檢驗(yàn)；其余計(jì)量資料數(shù)據(jù)以2結(jié)果2.1eml對(duì)小鼠確定的影響與溶劑對(duì)照組比較，DLX20mg/kg組及EML低、中、高劑量組小鼠爬格次數(shù)和直立次數(shù)均無顯著性差異，提示EML在受試劑量下無中樞興奮或抑制作用（表1）。2.2eml的不動(dòng)時(shí)間抑制率與溶劑對(duì)照組比較，DLX20mg/kg與EML100和400mg/kg均可顯著縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)時(shí)間抑制率分別為90.7%、35.5%、41%(P<0.01、P<0.05、P<0.01，表2），提示EML具有抗抑郁作用。2.3eml對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響與溶劑對(duì)照組比較，DLX20mg/kg、EML100mg/kg均可顯著縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)時(shí)間抑制率分別為83.5%、35.3%，（均為P<0.01，表3），提示EML具有抗抑郁作用。2.4eml對(duì)小鼠確定的影響與溶劑對(duì)照組小鼠比較，DLX20mg/kg組及EML低、中、高劑量組小鼠爬格次數(shù)和直立次數(shù)均無顯著性差異，提示EML在受試劑量下無中樞興奮或抑制作用（表4）。2.5eml的抑制效果與溶劑對(duì)照組比較，DLX20mg/kg與EML400mg/kg可顯著縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)時(shí)間抑制率分別為78.4%、29.1%(P<0.01、P<0.05，表5），提示EML具有抗抑郁作用。2.6eml的抗抑郁作用與溶劑對(duì)照組比較，DLX20mg/kg、EML400mg/kg可顯著縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)時(shí)間抑制率分別為38.1%、23.1%(P<0.01、P<0.05，表6），提示EML具有抗抑郁作用。2.7eml單次給藥對(duì)5-htp誘導(dǎo)小鼠扭頭行為的影響與溶劑對(duì)照組相比，EML100mg/kg和DLX20mg/kg組可顯著增加5-HTP(120mg/kg）誘導(dǎo)小鼠甩頭次數(shù)，甩頭次數(shù)分別增加了40.7%、90.4%(P<0.05,P<0.01，表7），提示EML有增強(qiáng)5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用。2.8eml對(duì)小鼠死亡率的影響溶劑對(duì)照組小鼠sc給予育亨賓20mg/kg后24h內(nèi)死亡率為0/10，與溶劑對(duì)照組相比，DLX20mg/kg顯著增加了小鼠的死亡率（P<0.01），而EML對(duì)小鼠的死亡率無顯著性影響（表8）。2.9eml對(duì)利血平化的影響小鼠ip給予利血平1h后，與溶劑對(duì)照組相比，利血平模型組小鼠行為出現(xiàn)明顯改變，即眼瞼下垂、體溫降低和運(yùn)動(dòng)不能（不出圈率增加）（P<0.01,P<0.01,P<0.05），表明利血平化模型成功。與模型組比較，DLX對(duì)利血平引起的上述行為反應(yīng)除運(yùn)動(dòng)不能外，均有顯著逆轉(zhuǎn)作用（P<0.01,P<0.05);EML400mg/kg可顯著減少小鼠眼瞼下垂得分（P<0.05），但對(duì)利血平化引起的體溫降低和運(yùn)動(dòng)不能無顯著影響；EML100mg/kg和200mg/kg對(duì)以上3項(xiàng)指標(biāo)均無顯著影響（表9）。3eml的抗抑郁作用機(jī)制現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑葉主要具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、抗焦慮和神經(jīng)保護(hù)本研究采用小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾兩個(gè)行為絕望模型對(duì)EML的抗抑郁作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。該模型中，小鼠在拼命掙扎試圖逃脫而又無法逃脫后出現(xiàn)不動(dòng)狀態(tài)，稱之為絕望行為，有效的抗抑郁劑可抑制這種絕望行為，表現(xiàn)為不動(dòng)時(shí)間的縮短抑郁癥的單胺假說認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生與腦內(nèi)5-HT和（或）NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)降低有關(guān)。目前多數(shù)已上市抗抑郁藥是在單胺假說的指導(dǎo)下研發(fā)，5-HT重?cái)z取抑制劑、5-HT/NE雙重重?cái)z取抑制劑等一線抗抑郁藥物均是通過增強(qiáng)單胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)揮治療作用5-HTP是5-HT的前體，給予小鼠5-HTP后，其外源性5-HT水平增加，通過激動(dòng)腦內(nèi)5-HT作為a進(jìn)而，本研究以利血平誘導(dǎo)的抑郁動(dòng)物模型為研究對(duì)象，進(jìn)一步驗(yàn)證EML抗抑郁的作用