十二核酸的生物合成專家講座

第十二章核酸生物合成十二核酸的生物合成專家講座第1頁

主要內(nèi)容一

DNA生物合成二

RNA生物合成十二核酸的生物合成專家講座第2頁中心法則

（centraldogma）

復(fù)制：是親代雙鏈DNA按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確形成兩個(gè)相同核苷酸序列子代DNA分子過程。兩條DNA鏈都可作為復(fù)制模板。

轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲(chǔ)存遺傳信息按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)mRNA過程。

翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列過程。

中心法則：遺傳信息由DNAmRNAPro流動(dòng)路徑。

十二核酸的生物合成專家講座第3頁蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA中心法則：遺傳信息由DNAmRNAPro流動(dòng)路徑。補(bǔ)充和完善之處：A：RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復(fù)制，并作為mRNA指導(dǎo)Pro合成。B：RNA能以逆轉(zhuǎn)錄方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。十二核酸的生物合成專家講座第4頁十二核酸的生物合成專家講座第5頁十二核酸的生物合成專家講座第6頁

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶催化下按堿基互補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)合成兩條與模板鏈互補(bǔ)新鏈，以組成新DNA分子。這么新形成兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子堿基次序完全一樣。因?yàn)樽哟鶧NA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。一、

DNA生物合成

（一）半保留復(fù)制

十二核酸的生物合成專家講座第7頁

[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNA1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)識(shí)加密度梯度離心技術(shù)試驗(yàn),證實(shí)了DNA是采取半保留方式進(jìn)行復(fù)制.DNA半保留復(fù)制試驗(yàn)依據(jù)十二核酸的生物合成專家講座第8頁

Meselson-stahl試驗(yàn)（a）密度梯度離心DNA帶（b）對(duì)應(yīng)于左側(cè)DNA帶解釋十二核酸的生物合成專家講座第9頁（二）DNA復(fù)制起點(diǎn)和方向

復(fù)制叉（replicationforks）

：復(fù)制中DNA分子，未復(fù)制部分是親代雙螺旋，而復(fù)制好部分是分開，由兩個(gè)子代雙螺旋組成，復(fù)制正在進(jìn)行部分叫做復(fù)制叉。細(xì)胞內(nèi)存在著能識(shí)別起始點(diǎn)特種Pr。

十二核酸的生物合成專家講座第10頁

方向：復(fù)制叉從起始點(diǎn)出發(fā)，沿DNA移動(dòng)，移動(dòng)方向與前導(dǎo)鏈延長方向相同。復(fù)制可能是單向，也可能是雙向，兩個(gè)方向復(fù)制速度不一定相同。大多數(shù)是雙向。

眼狀結(jié)構(gòu)：線狀DNA分子上正在復(fù)制部分形成；

θ結(jié)構(gòu)：環(huán)狀DNA分子上正在復(fù)制部分形成。

十二核酸的生物合成專家講座第11頁DNA雙向和單向復(fù)制環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成Q結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制十二核酸的生物合成專家講座第12頁兩種復(fù)制模式（a）單向復(fù)制模式（b）大腸桿菌染色體DNA雙向復(fù)制模式十二核酸的生物合成專家講座第13頁單向復(fù)制i雙向復(fù)制觀察到放射自顯影圖象十二核酸的生物合成專家講座第14頁18%質(zhì)粒ColE1單向復(fù)制示意圖單向復(fù)制十二核酸的生物合成專家講座第15頁最早研究DNA復(fù)制起點(diǎn)和方向是J.Cairns（1963年）。θ型十二核酸的生物合成專家講座第16頁DNAReplication十二核酸的生物合成專家講座第17頁原核生物：只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)。第二次復(fù)制可在第一次復(fù)制完成之前開始復(fù)制。真核生物；可在DNA鏈上多個(gè)不一樣位點(diǎn)同時(shí)起始復(fù)制。

所以真核生物DNA復(fù)制速度比原核生物快些。

十二核酸的生物合成專家講座第18頁真核生物DNA多起點(diǎn)復(fù)制十二核酸的生物合成專家講座第19頁（三）DNA復(fù)制過程（原核生物）

DNA合成是以四種脫氧核苷三磷酸即dATP、dGTP、dCTP、dTTP為前體，在DNA聚合酶催化下，向DNA3′—OH端添加脫氧核苷酸，在DNA3′—OH與添加脫氧核苷酸5′—磷酰基間形成3，5—磷酸二酯鍵，反應(yīng)中脫去一個(gè)焦磷酸基團(tuán)。

合成方向：5′3′

十二核酸的生物合成專家講座第20頁添加到鏈上每個(gè)核苷三磷酸是按照模板鏈次序由堿基互補(bǔ)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)選擇。

反應(yīng)通式可寫為：（NMP）n—3′—OH＋dNTP

（NMP）n＋1—3′—OH＋PPi

十二核酸的生物合成專家講座第21頁1、DNA聚合酶ⅠpolⅠ

(1)具5′3′聚合酶活性將脫氧核糖核苷三磷酸dNTP逐一添加到含有3′—OH末端多核苷酸鏈上形成3，5—磷酸二酯鍵。

特點(diǎn)：A：底物為dNTP；B：DNA模板(3′5′)；C：引物：RNA引物（帶3′—羥基）；D：方向5′3′；F：產(chǎn)物DNA性質(zhì)與模板相同。十二核酸的生物合成專家講座第22頁DNA聚合酶催化鏈延長反應(yīng)5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′模板鏈?zhǔn)怂岬纳锖铣蓪＜抑v座第23頁

(2)含有3′5′端核酸外切酶活性

有校對(duì)功效，能在3′—OH端將DNA鏈水解。以確保DNA復(fù)制真實(shí)性。

十二核酸的生物合成專家講座第24頁DNA聚合酶3′-5′外切酶水解位點(diǎn)3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)十二核酸的生物合成專家講座第25頁(3)含有5′3′端核酸外切酶活性由5′端水解DNA鏈，主要是切去一小段DNA，包含RNA引物和損傷DNA部分。

polⅠ主要功效：用于修復(fù)DNA雙螺旋區(qū)中單鏈區(qū)，這些單鏈區(qū)是在DNA復(fù)制時(shí)或DNA受損傷后留下。活性高。

十二核酸的生物合成專家講座第26頁DNA聚合酶5′-3′外切酶活力

5′-3′核酸外切酶水解位點(diǎn)單鏈缺口5′十二核酸的生物合成專家講座第27頁2、DNA聚合酶ⅡpolⅡ

含有3′5′端核酸外切酶活性，主要負(fù)責(zé)DNA修復(fù)，在一定程度上參加DNA復(fù)制?；钚缘?。功效不十分清楚，是一個(gè)修復(fù)酶。

十二核酸的生物合成專家講座第28頁3、DNA聚合酶ⅢpolⅢ是使DNA鏈延長主要聚合酶，當(dāng)前已知全酶是由7種多肽形成復(fù)合物，含有10種共22個(gè)亞基組分（α2ε2θ2ζ2г2δ2δ2′2χ2ψ2β2）和Zn原子。十二核酸的生物合成專家講座第29頁大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)和功效

延長因子DNA聚合酶Ⅲ兩個(gè)亞基夾住DNADNA聚合酶Ⅲ異二聚體關(guān)鍵酶校對(duì)引物結(jié)合和識(shí)別促使關(guān)鍵酶二聚化十二核酸的生物合成專家講座第30頁（1）α亞基：具5′

3′端聚合酶活性（需模板和引物）；（2）ε亞基具3′

5′端核酸外切酶活性。校對(duì)作用，以提升保真性；（3）α、ε、θ亞基相連形成關(guān)鍵酶polⅢ，θ亞基起組建作用；（4）關(guān)鍵酶+ζ亞基后成為二聚體，稱為polⅢ′；（5）polⅢ′與γ、δ亞基結(jié)合，形成polⅢ′，γ、δ亞基可增強(qiáng)酶與模板結(jié)合；（6）polⅢ′′與β亞基結(jié)合形成全酶，β亞基如同夾子，夾住DNA向前滑動(dòng)，不脫離，提升連續(xù)合成能力。

十二核酸的生物合成專家講座第31頁大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶Ⅰ109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20++-50比較項(xiàng)目DNA聚合酶III切除引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制功效

1999年發(fā)覺聚合酶

和

，它們包括DNA錯(cuò)誤傾向修復(fù)（erroounerepair）十二核酸的生物合成專家講座第32頁polⅠ不是DNA復(fù)制酶，理由：A、該酶合成DNA速度太慢，只是細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制速度1%；B、連續(xù)合成能力較低，而細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制不會(huì)頻繁中止；C、許多基因突變都會(huì)影響DNA復(fù)制，但都與polⅠ無關(guān)。

十二核酸的生物合成專家講座第33頁

3、雙鏈DNA復(fù)制分子機(jī)制（1）岡崎片段和半不連續(xù)復(fù)制不連續(xù)復(fù)制：3’→5’走向DNA實(shí)際上是由許多5’→3’方向合成DNA片段連接起來。（已知DNA聚合酶合成方向都是5’→3’）十二核酸的生物合成專家講座第34頁在一個(gè)復(fù)制叉內(nèi)兩條鏈復(fù)制方向、合成方式、復(fù)制速度是不一樣。

前導(dǎo)鏈（leadingstrand)：以一條鏈（3’→

5’）為模板時(shí)，子代鏈合成方向是5’→3’，合成是連續(xù)，合成速度較快。

十二核酸的生物合成專家講座第35頁后隨鏈(laggingstrand):以另一條親代鏈（5’→

3’）為模板時(shí)，子代鏈合成方向不能按照3’→5’方向進(jìn)行，因?yàn)槠駴]有發(fā)覺這么DNA聚合酶，所以只能合成方向?yàn)?’→

3’方向許多DNA小片段（約1000--------dp，7-----10S），為1968年日本人岡崎等人發(fā)覺，叫岡崎片段，然后在DNA連接酶催化下，連接起來形成一條子代鏈。合成是不連續(xù)，合成速度較慢。當(dāng)一段新岡崎片段合成后，polⅠ行使5’→3’核酸外切酶活性切除引物，再合成一段DNA作為替換，缺口由DAN連接酶封口。

十二核酸的生物合成專家講座第36頁(2)岡崎片段RNA引物引物合成由引物合成酶催化完成，這些酶在模板單鏈DNA上識(shí)別特殊序列，合成RNA引物。它本身沒有活性，需要與“引發(fā)前體”結(jié)合在一起，形成“引發(fā)體”后才有活性。引發(fā)體在復(fù)制叉上移動(dòng)，識(shí)別合成起始點(diǎn)，引發(fā)RNA引物合成，該過程需ATP提供能量。十二核酸的生物合成專家講座第37頁方向：以DNA為模板，5’→3’長度：幾個(gè)至10個(gè)核苷酸，5′端含3個(gè)磷酸殘基，3′端為游離羥基。DNA聚合酶III

：聚合脫氧核糖核苷酸引物消除和缺口填補(bǔ)：DNA聚合酶IDNA連接酶：將岡崎片段連成長鏈?zhǔn)怂岬纳锖铣蓪＜抑v座第38頁為何需要RNA引物、而且最終要切除？1、DNA聚合酶有校正功效，每引入一個(gè)核苷酸都要復(fù)查一次，無誤后方繼續(xù)下去，它不能從無到有合成新鏈，因?yàn)樵谖春藢?shí)前一個(gè)核苷酸處于正確配對(duì)狀態(tài)時(shí)是不會(huì)進(jìn)行聚合反應(yīng)；2、RNA引物是從新開始合成，錯(cuò)配可能性大，在完成引物功效后即將它刪除，而代之以高保真DNA鏈。

十二核酸的生物合成專家講座第39頁解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物十二核酸的生物合成專家講座第40頁十二核酸的生物合成專家講座第41頁（3）DNA連接酶催化子代雙鏈DNA中切口處相鄰3’-OH和5’-磷?；g形成磷酸二酯鍵。但不能將兩條游離DNA單鏈連接起來。同時(shí)該酶要求含有3’-OH和5’-磷?；鵇NA片段能以氫鍵與互補(bǔ)鏈結(jié)合。

DNA—3′—OH＋P—5′—DNA＋ATP（NAD+）

DNA—3′—O—P—5′—DNA＋AMP＋PPi（NMN）

十二核酸的生物合成專家講座第42頁

E,coli連接酶催化下連接機(jī)制十二核酸的生物合成專家講座第43頁連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋AMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈?zhǔn)怂岬纳锖铣蓪＜抑v座第44頁（4）母本DNA雙鏈分離解螺旋酶（helicase）使DNA雙螺旋兩條鏈分開。條件：ATP提供能量，有單鏈DNA存在。后隨鏈：解旋酶結(jié)合于它模板上，移動(dòng)方向是5′3′前導(dǎo)鏈：另一個(gè)解旋酶叫rep蛋白，移動(dòng)方向是3′5′。

十二核酸的生物合成專家講座第45頁單鏈結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein，SSB）結(jié)合在單鏈DNA分子上，功效是穩(wěn)定已被解開DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。

十二核酸的生物合成專家講座第46頁拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA松弛酶）（topoisomerase）包括超螺旋松弛，復(fù)制后又包括到它們?cè)俅涡纬伞?/p>

正超螺旋（左）：雙螺旋DNA處于擰緊狀態(tài)時(shí)形成超螺旋，使DNA解開雙螺旋困難負(fù)超螺旋（右）：雙螺旋DNA處于擰松狀態(tài)時(shí)形成超螺旋。十二核酸的生物合成專家講座第47頁拓?fù)洚悩?gòu)酶對(duì)DNA超螺旋進(jìn)行準(zhǔn)確調(diào)整，從而在DNA重組修復(fù)和DNA其它轉(zhuǎn)變中起作用。分為兩類：1、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ：可瞬時(shí)打開雙螺旋一條鏈，然后再連接。不需能量，同轉(zhuǎn)錄相關(guān)。2、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ；使DNA雙鏈同時(shí)斷裂，然后再連接。需能量ATP，同復(fù)制相關(guān)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可除去負(fù)超螺旋，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制前產(chǎn)生正超螺旋，協(xié)同作用控制DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，有利于DNA解開雙螺旋。十二核酸的生物合成專家講座第48頁參加大腸桿菌染色體DNA復(fù)制主要PrDNA旋轉(zhuǎn)酶→引入（或松解）DNA解鏈酶→使雙螺旋DNA解鏈單鏈結(jié)合蛋白→穩(wěn)定單鏈區(qū)引物合成酶→合成RNA引物DNA聚合酶III全酶→合成DNADNA聚合酶I→除去引物并填滿缺口DNA連接酶→連接DNA片段末端十二核酸的生物合成專家講座第49頁（5）DNA聚合酶“校對(duì)”作用DNA聚合酶含有三種不一樣酶活性。3’→5’外切酶活性是校對(duì)新生DNA鏈和更正聚合酶活性所造成“錯(cuò)配”一個(gè)伎倆?，F(xiàn)在所發(fā)覺真核生物DNA聚合酶普通沒有校正功效。十二核酸的生物合成專家講座第50頁DNA聚合酶校對(duì)功效聚合酶錯(cuò)配堿基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸十二核酸的生物合成專家講座第51頁（四）真核細(xì)胞DNA復(fù)制不十分清楚，與原核生物DNA復(fù)制比較：

（一）一致：1、基本機(jī)制相同。如半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制。2、所需酶相同。十二核酸的生物合成專家講座第52頁（二）區(qū)分

真核生物

原核生物復(fù)制起始點(diǎn)

多個(gè)

一個(gè)復(fù)制方向

雙向

單向復(fù)制速度

較快

較慢起始點(diǎn)是否連續(xù)復(fù)制

不

是催化DNA鏈延長酶

兩種酶（polα、δ）

一個(gè)酶（polⅢ）引物酶結(jié)合情況

與DNA聚合酶

與解旋酶十二核酸的生物合成專家講座第53頁DNA聚合酶αβγδε定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核亞基數(shù)目412最少2>1外切酶活性無無3’→5’3’→5’3’→5’引物合成酶活性有無無無無功效復(fù)制過程中合成后隨鏈參加核DNA修復(fù)線粒體DNA復(fù)制催化前導(dǎo)鏈合成參加DNA修復(fù)十二核酸的生物合成專家講座第54頁端粒復(fù)制（1）半保留復(fù)制（2）可朝一個(gè)方向或兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制（3）DNA兩條鏈都從5’→3’（4）復(fù)制是半不連續(xù)，前導(dǎo)鏈連續(xù)，后隨鏈不連續(xù)合成（5）合成始于一小段RNA引物（6）復(fù)制有各種機(jī)制十二核酸的生物合成專家講座第55頁（五）反轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)DNA合成）指以RNA為模板合成DNA過程。

最先在病毒中發(fā)覺這種酶，現(xiàn)在發(fā)覺存在于哺乳動(dòng)物胚胎和正在分裂細(xì)胞中。

十二核酸的生物合成專家講座第56頁條件1、反轉(zhuǎn)錄酶：是一個(gè)多功效酶，具以下特征：（1）以RNA為模板合成DNA；（2）水解RNA，具3’→5’和5’→3’外切酶活性；（3）以DNA為模板合成DNA。2、前體物質(zhì)：dNTP3、引物：短鏈RNA或DNA

適當(dāng)濃度Mg2＋、Mn2＋4、方向：5’→3’十二核酸的生物合成專家講座第57頁過程1、以親代RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)DNA鏈（cDNA），形成RNA—DNA雜交分子。2、由核糖核酸酶H水解RNA—DNA雜交分子中RNA鏈；3、以剛合成DNA鏈為模板合成一條互補(bǔ)DNA鏈，形成DNA—DNA分子；4、DNA—DNA去向（1）整合到宿主細(xì)胞DNA分子中，但不表示；（2）DNA—DNA再轉(zhuǎn)錄合成RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)，生成子代RNA病毒。十二核酸的生物合成專家講座第58頁反轉(zhuǎn)錄過程中cDNA合成

依賴RNADNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNADNA聚合酶十二核酸的生物合成專家講座第59頁十二核酸的生物合成專家講座第60頁突變基因組DNA堿基次序發(fā)生突然而永久性改變。

1、點(diǎn)突變：指一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)被置換。有兩種形式：轉(zhuǎn)換：一個(gè)嘌呤堿基或一個(gè)嘧啶堿基轉(zhuǎn)換為另一個(gè)嘌呤或嘧啶堿基。如TA被CG替換。顛換：嘌呤堿基變成嘧啶堿基或嘧啶堿基變成嘌呤堿基。如TA被AT替換。2、結(jié)構(gòu)畸變DNA大段堿基發(fā)生改變。包含：插入、缺失、倒位、易位。

（六）DNA損傷與修復(fù)十二核酸的生物合成專家講座第61頁

DNA突變類型

-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-轉(zhuǎn)換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基正確置換(substitution)移碼突變(framesshiftmutation)

-T-C-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-插入

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失AT十二核酸的生物合成專家講座第62頁造成DNA損傷原因可能是生物原因、物理原因或是化學(xué)原因；可能來自細(xì)胞內(nèi)部，也可能來自細(xì)胞外部；受到破壞可能是DNA堿基、糖基或是磷酸二酯鍵。物理誘變劑：如紫外線、X射線等。生物誘變劑：如噬菌體、抗菌素等?；瘜W(xué)誘變劑：直接作用于DNA模板誘變劑，