醛脫氫酶基因敲除菌的構建及應用

醛脫氫酶基因敲除菌的構建及應用

1.3-丙二醇（1.3-pd）是重要的化工原料。近年來，它的微生物生產(chǎn)方法引起了人們的注意，并進行了深入的研究。但仍然存在著產(chǎn)物得率較低,生產(chǎn)成本較高等問題,制約了其工業(yè)化生產(chǎn)1材料和方法1.1材料表面1.1.1其他和配體的生物工程四環(huán)素鹽酸鹽購自Sigma公司;限制性內切酶,包括EcoRI,HindIII,AvaI及BsaAI等均購自寶生物工程有限公司或NEB公司。PCR相關試劑購自寶生物工程有限公司,其它試劑購自北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心。1.1.2菌株、谷物、培養(yǎng)基菌株、質粒及培養(yǎng)基見表1。1.2方法1.2.1入質構和hondiii酶切位點其中A1和A2用來擴增ALDH基因序列,分別引入EcoRI和HindIII酶切位點。P1和P2擴增Tcr基因,分別引入AvaI和BsaAI限制性內切酶識別位點,用來插入到ALDH基因中間使之被缺失。1.2.2重組載體pucaALDH基因敲除的重組質粒的構建示意圖見圖1。以A1和A2為引物,從KlebsiellapneumoniaeM5aL基因組上擴增得到約1.45kb的ALDH基因片段。用EcoRI和HindIII雙酶切該片段和pUC18質粒,將兩者定向連接起來得到質粒pUC18-ALDH(即圖1中質粒pUCA1)。以P1和P2為引物從質粒pBR322上擴增得到約1.65kb的Tcr基因片段,用AvaI和BsaAI雙酶切后插入到質粒pUC18-ALDH上ALDH基因的AvaI和BsaAI酶切位點之間,得到ALDH基因敲除的重組載體pUCAT。質粒用質粒純化試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司產(chǎn)品)提取。分子生物學操作見文獻[5]。1.2.3同源重組構建ALDH基因缺失的K.pneumoniae重組菌以A1和A2為引物從重組載體pUCAT擴增長度約3.1kb的DNA片段5′ALDH-Tcr-3′ALDH,參照《分子克隆實驗指南》的方法,將得到的M5aL,涂布于四環(huán)素抗性篩選平板,篩選同源雙交換的1.2.4aldh酶活測定細胞粗酶液的制備采用超聲破碎的方法:收集發(fā)酵液經(jīng)13000r/min,4℃離心2min后棄去上清液,將菌泥用適量預冷的50mmol/L甘氨酸/NaOH緩沖液(pH9.5)洗滌后再次離心。將菌泥用5～8ml50mmol/L甘氨酸/NaOH緩沖液(pH9.5)重懸后進行超聲破碎,經(jīng)(3s+3s)×99次超聲后的細胞破碎液經(jīng)13000r/min,4℃離心20min,所得上清液即可用于ALDH酶活測定。根據(jù)文獻[6],對細胞粗酶液測ALDH酶活可利用其逆反應,通過測定吸收峰在340nm處的NADH的增量進行換算:Acetaldehyde+CoA-SH+NAD2結果2.1aldh基因及aldh基因檢測以K.pneumoniaeM5aL基因組為模板,A1和A2為引物擴增ALDH基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖電泳,得到了約1.45kb的特異條帶(見圖2a),經(jīng)酶切電泳分析初步確定該條帶為ALDH基因。以pBR322為模板,P1和P2為引物擴增得到1.65kb的四環(huán)素抗性基因(Tcr)(見圖2b)。2.2pvoii檢測中間載體pUC18-ALDH的基本結構如圖3(a)(pUCA1)所示,經(jīng)BamHI及PvuII分別酶切的電泳圖譜如圖3(b)所示,其結構正確無誤。進一步利用pUC18/M13上下游通用引物測定該質粒中外源片段的序列,雙向測序后拼接得到一條1440bp長的核苷酸序列,通過與GenBank報導的K.pneumoniaeALDH基因比較,鑒定為正確的克隆及載體。2.3uc18的構建目標載體pUCAT由5′ALDH-Tcr-3′ALDH-pUC18構成見圖4(a),經(jīng)HindIII,HindIII-EcoRI,PstI及PstI-ScaI分別酶切的電泳圖譜如圖4(b)所示,其結果與設計的結構相符。2.4aldh基因缺失的重組菌的認定經(jīng)過反復的抗性篩選和純化,得到2株菌0623-1hb和0623-1hc,對這兩株菌進行菌落PCR(引物采用A1和A2),如圖5所示,均得到3.1kb的唯一的DNA片段酶切檢驗結果表明該片段由Tcr-3′ALDH組成,與預期一致,可以初步認定0623-1hb和0623-1hc是ALDH基因缺失的重組菌。對這兩主菌進行ALDH酶活測定,也達到預期效果。如圖6所示,重組菌0623-1hb及0623-1hc基本檢測不到ALDH酶活,與出發(fā)菌株K.pneumoniaeM5aL(0.181U/gprotein)相比,兩株重組菌的殘余ALDH比酶活均在0±2%的實驗誤差范圍內,說明兩株菌的ALDH基因確已敲除。初步研究結果表明,與出發(fā)菌株K.pneumoniaeM5aL相比,厭氧代謝甘油時重組菌0623-1hb及0623-1hc合成的1,3-PD濃度分別提高了27.1%和42.4%,而乙醇合成濃度分別下降了53.1%和42.7%(見圖7所示)。以上結果表明,利用同源重組技術構建ALDH基因敲除的重組菌對提高產(chǎn)量和減少副產(chǎn)物合成是切實可行的。3同源重組病毒的構建本文構建了ALDH基因敲除的載體pUCAT,由5′-ALDH-Tcr-3′ALDH-pUC18組成,經(jīng)DNA測序及限制性酶切電泳分析,構建的載體與設計的結構相符。利用該載體,通過同源重組技術成功構建了ALDH基因缺失的K.pneumoniae重組菌0623-1hb及0623-1hc,菌落PCR鑒定及A