血液細(xì)胞組織化學(xué)

概述

細(xì)胞化學(xué)染色是在組織化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來一個(gè)學(xué)科分支，是細(xì)胞學(xué)與化學(xué)相結(jié)合而形成一門科學(xué)，研究細(xì)胞化學(xué)成份，在保留血液細(xì)胞形態(tài)基礎(chǔ)上，在細(xì)胞原位顯示化學(xué)反應(yīng)結(jié)果，依據(jù)化學(xué)反應(yīng)原理，研究細(xì)胞成份化學(xué)性質(zhì)。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第1頁研究目標(biāo)及臨床應(yīng)用

研究正常血液細(xì)胞活動(dòng)與生理功效提升血液病診療和判別診療水平

確定急性白血病類型

有利于一些血液病判別診療觀察療效和預(yù)計(jì)預(yù)后

探索一些血液病發(fā)病原理及治療機(jī)制

血液細(xì)胞組織化學(xué)第2頁標(biāo)本選擇

BM片、血片、淋巴結(jié)印片、脾印片等均可作組化染色。用于酶染色標(biāo)本應(yīng)盡可能新鮮。用于非酶染色標(biāo)本可在室溫下放置1個(gè)月，如PAS標(biāo)本。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第3頁固定目標(biāo)及方法

目標(biāo)保持細(xì)胞生前結(jié)構(gòu)與化學(xué)成份，并使血膜在染色、沖洗過程中不易脫落損壞。慣用化學(xué)固定方法

甲醛蒸汽固定：將濾紙平鋪于染色缸底部，加入少許40%甲醛溶液。將涂片標(biāo)本放入缸內(nèi)，加蓋使甲醛蒸汽固定血膜5-10分鐘，水洗后晾干。液體固定：慣用固定液為乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用兩種或兩種以上成份組成混合固定液。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第4頁顯示方法

純化學(xué)方法

金屬沉淀法

偶氮偶聯(lián)法

聯(lián)苯胺色素法

Schiff反應(yīng)

普魯士藍(lán)反應(yīng)類化學(xué)方法

物理學(xué)方法血液細(xì)胞組織化學(xué)第5頁復(fù)染方法

復(fù)染是細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成份顯色后，為了便于觀察而進(jìn)行對比染色方法。

細(xì)胞核復(fù)染法：慣用染料為蘇木精、甲基綠、核固紅、沙黃等。

細(xì)胞漿復(fù)染法：慣用染料為伊紅、光綠等血液細(xì)胞組織化學(xué)第6頁過氧化物酶染色（Peroxidasestain,POX）血液細(xì)胞組織化學(xué)第7頁目標(biāo)急性白血病判別診療AML：陽性ALL：陰性血液細(xì)胞組織化學(xué)第8頁分布特點(diǎn)-1原粒細(xì)胞：陰性，白血病副原粒細(xì)胞可呈陽性反應(yīng)。中性粒細(xì)胞：自早幼粒細(xì)胞起隨細(xì)胞成熟陽性強(qiáng)度遞增。陽性顆粒圓形，規(guī)則，直徑與嗜蘇丹黑顆粒相仿，比瑞氏染色特殊顆粒大。嗜酸粒細(xì)胞：陽性反應(yīng)，顆粒比中性粒細(xì)胞大，著色深。嗜堿粒細(xì)胞：陰性反應(yīng)，在CML時(shí)可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。血液細(xì)胞組織化學(xué)第9頁分布特點(diǎn)-2在粒細(xì)胞系統(tǒng)中，過氧化物酶顆粒出現(xiàn)和增多與特殊顆粒出現(xiàn)和增多有平行關(guān)系。單核細(xì)胞系：原單呈陰性反應(yīng)，幼單和單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)。陽性顆粒少而細(xì)小，彌散分布，有也可呈陰性反應(yīng)。其它細(xì)胞：淋巴細(xì)胞、巨核細(xì)胞、血小板、幼紅細(xì)胞、漿細(xì)胞和組織細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。有吞噬細(xì)胞可呈陽性反應(yīng)血液細(xì)胞組織化學(xué)第10頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第11頁試劑配制0.3%聯(lián)苯胺酒精溶液：

聯(lián)苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亞硝基鐵氰化鈉飽和水溶液1ml?？杀Ａ?-2年。

過氧化氫溶液配制：

3%過氧化氫1滴+蒸餾水5ml，須每次用時(shí)新鮮配制。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第12頁染色步驟于新鮮涂片上滴加復(fù)方聯(lián)苯胺染液3－8滴，使涂片蓋滿。1－2分鐘后加入等量過氧化氫溶液。4－8分鐘后用水沖洗，空氣中晾干。用瑞氏染液復(fù)染，涼干后油鏡觀察。血液細(xì)胞組織化學(xué)第13頁染色原理

粒細(xì)胞及部分單核細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒中含有過氧化物酶，該酶能分解過氧化氫，釋放出新生態(tài)氧。從而使無色聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)是一個(gè)不穩(wěn)定中間產(chǎn)物，它可深入氧化變成棕色化合物

血液細(xì)胞組織化學(xué)第14頁結(jié)果判斷陽性反應(yīng)為藍(lán)色或藍(lán)棕色顆粒，定位于胞漿中。血液細(xì)胞組織化學(xué)第15頁臨床意義ALL時(shí)，原始細(xì)胞POX陽性小于3%。AML時(shí)，原始細(xì)胞陽性≥3%。在多數(shù)M1、絕大部分M2和M3中，原始細(xì)胞陽性率大于85%。M4和M5時(shí)，原單有時(shí)可呈弱陽性，但絕大多數(shù)原單是POX陰性。M6，原粒和幼稚粒細(xì)胞是POX陽性，幼紅細(xì)胞是POX陰性。在M7，血小板POX活性只能在超微結(jié)構(gòu)上證實(shí)。MDS時(shí)，粒細(xì)胞白血病和感染所致WBC增高時(shí)，成熟中性粒細(xì)胞POX活性可能降低或消失。CML時(shí)，成熟中性粒細(xì)胞POX活性增強(qiáng)。血液細(xì)胞組織化學(xué)第16頁注意事項(xiàng)

已固定血膜因?yàn)槊敢哑茐牟荒茉僮鬟^氧化物酶染色。所用過氧化氫必須新鮮，加于血膜上應(yīng)能發(fā)生泡沫。過量時(shí)紅細(xì)胞可出現(xiàn)假陽性。過氧化氫濃度要適當(dāng)加減，過量則顆粒色深，不足則顆粒色淡。滴加過氧化氫液之后，最好將染片置于載物臺(tái)上，用低倍鏡觀察，發(fā)覺胞漿出現(xiàn)陽性顆粒時(shí)，馬上水洗。血液細(xì)胞組織化學(xué)第17頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第18頁

糖原染色

（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）血液細(xì)胞組織化學(xué)第19頁目標(biāo)

紅白血?。?+++）與巨幼紅細(xì)胞貧血（-）判別診療MDS與巨幼紅細(xì)胞貧血（-）判別診療單核細(xì)胞白血病（+）與組織細(xì)胞?。∕H）判別診療淋巴肉瘤、何杰金病與急性淋巴細(xì)胞白血病判別診療高歇病與尼曼-匹克病判別診療

以上都是前者增高，后者降低或陰性。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第20頁試劑-110g/L過碘酸液Schiff染液：堿性品紅0.5gDH2O100mlDH2O煮沸后待片刻，加入堿性品紅，振蕩數(shù)分鐘使品紅溶解，冷至50℃加入1M鹽酸20ml，混勻。待冷卻至25℃加入偏重亞硫酸鈉0.5g，混合，置于帶塞棕色瓶中，放于暗處24小時(shí)。染液為無色，如為微紅則加活性炭1－2g，混合過濾，如過濾液仍有紅色，應(yīng)再加少許活性炭，至紅色完全被吸收為止。制成后置于棕色瓶內(nèi)保留在冰箱備用，如變?yōu)榧t色，則不能使用。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第21頁試劑-2

蘇木素液：蘇木素0.9g95％乙醇10ml銨（鉀）明礬20gDH2O200ml將蘇木素溶于95％乙醇，鉀明礬溶于水（可加熱），然后將蘇木素液加入明礬液中混合，用強(qiáng)火煮沸后加氧化汞0.5g，快速攪拌，呈深紫色，快速移入冷水中，次日過濾，臨用時(shí)取此液95ml加冰醋酸5ml，可使細(xì)胞著色清楚。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第22頁染色步驟

將新鮮血片或骨髓片用95％乙醇固定10分鐘。10g/L過碘酸液作用20分鐘DH2O洗滌1分鐘，晾干Schiff染液，60分鐘用自來水洗滌15分鐘（細(xì)水長流沖洗）蘇木素染液10分鐘。自來水沖洗15分鐘，待干鏡檢。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第23頁染色原理

過碘酸能使細(xì)胞內(nèi)多糖乙二醇基氧化成二醛，再與Schiff氏液無色品紅結(jié)合，呈紅色，定位于胞漿上。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第24頁結(jié)果判斷

正常BM：有核紅細(xì)胞幾乎均呈陰性反應(yīng)，在AML－M6，幼紅細(xì)胞為PAS強(qiáng)陽性。中性粒細(xì)胞：原粒細(xì)胞多為陰性，早幼粒階段開始呈PAS陽性，其后各階段陽性逐步增強(qiáng)。巨核細(xì)胞和血小板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核細(xì)胞為細(xì)小彌散陽性，PLT為粉紅色。ALL：能夠是密集粗塊狀顆粒，也能是細(xì)小彌散顆粒，或是這兩種顆?；旌稀LLPAS也可能為陰性，尤其是L3時(shí)。單核細(xì)胞白血病，原單細(xì)胞常為陰性，幼單和成熟單可有弱陽性或彌散陽性。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第25頁注意事項(xiàng)

1）

Schiff液變紅不能再用。2）

堿性品紅質(zhì)量很主要，如堿性品紅不合格，加活性炭，顏色也不被吸附。如無蘇木精復(fù)染液，可用1%甲綠復(fù)染25分替換。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第26頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第27頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第28頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第29頁非特異性酯酶染色血液細(xì)胞組織化學(xué)第30頁原理

非特異性酯酶是作用于短鏈脂肪酶，當(dāng)酯酶活性存在時(shí)，水解基質(zhì)中α－醋酸萘酚，與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性有機(jī)產(chǎn)物，定位于胞漿上。血液細(xì)胞組織化學(xué)第31頁試劑甲醛：基質(zhì)液：1/15M磷酸緩沖液PH7.440ml10g/Lα－醋酸萘酚50％丙酮液0.8ml重氮鹽（DiazoblueB）40mg血液細(xì)胞組織化學(xué)第32頁方法

新鮮涂片用甲醛蒸汽固定5分鐘。流水沖洗5分鐘，晾干。置于基質(zhì)液中37℃1小時(shí)，水洗泡10分鐘。20g/L甲綠復(fù)染20－30分鐘。水洗，晾干，鏡檢。血液細(xì)胞組織化學(xué)第33頁臨床意義

單核細(xì)胞系統(tǒng)呈陽性，伴伴隨細(xì)胞成熟而加強(qiáng)，對AL有判別診療作用。血液細(xì)胞組織化學(xué)第34頁非特異性酯酶-氟化鈉抑制試驗(yàn)同非特異性酯酶，只是在1ml作用液中，加入1.5mg氟化鈉，即可抑制單核細(xì)胞酯酶，故可作急性單核細(xì)胞白血病判別診療。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第35頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第36頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第37頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第38頁急性白血病中組化染色

白血病POXNSEPASALL

—+

+AML

M0+——

M1+(>3原始細(xì)胞)——

M2++——

M3++++—

M4++（原單細(xì)胞）—

M5—/+++—/+

M6+（原粒細(xì)胞）—+（幼紅細(xì)胞）

M7—++血液細(xì)胞組織化學(xué)第39頁

中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（AKP）

血液細(xì)胞組織化學(xué)第40頁目標(biāo)判別白血?。ǖ停┖桶籽樱ǜ撸┓磻?yīng)判別淋巴肉瘤（高）和何杰金病判別細(xì)菌性感染（高）與病毒性感染

血液細(xì)胞組織化學(xué)第41頁分布

血細(xì)胞堿性磷酸酶活性，主要見于成熟中性粒細(xì)胞，定位于胞漿中。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第42頁原理

細(xì)胞中AKP在PH9.5－9.6緩沖液中能使基質(zhì)中磷酸萘酚鈉水解，釋放出萘酚。后者與一個(gè)穩(wěn)定重氮鹽（慣用有固紫Fast--Garnet，GBC或固藍(lán)RR）偶聯(lián)，生成不溶性偶氮染料，沉積于細(xì)胞上。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第43頁試劑

95%乙醇固醬紫GBCAS-BI磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml0.2Mtris緩沖液：三羥甲基氨基甲烷2.43g+DH2O溶至100ml。0.05Mtris緩沖液（PH8.6-9.0）：0.2Mtris緩沖液25ml+0.1MHCL49ml貯存液：50mlAS-BI磷酸萘酚+PH8.80.05Mtris緩沖液50ml混勻，冰箱保留1%甲基綠

血液細(xì)胞組織化學(xué)第44頁染色步驟

新鮮BM片及血片待干95%乙醇固定10分鐘固醬紫1mg+2ml貯存液混勻，馬上滴加數(shù)滴在血片或BM片上，置37℃孵箱孵育30分鐘用蒸餾水快沖

放入1%甲綠中復(fù)染5分鐘用蒸餾水快沖，待干，鏡檢

血液細(xì)胞組織化學(xué)第45頁結(jié)果判斷

陽性顆粒呈紅色，定位于成熟中性粒細(xì)胞胞漿內(nèi)。

計(jì)數(shù)方法，按堿酶活性強(qiáng)弱，分為0-4+共5級。分?jǐn)?shù)特點(diǎn)0胞漿內(nèi)無紅色顆粒1彌散紅色，偶見顆粒2彌散紅色，有中等量顆粒3顯著紅色，有較多顆粒4顯著紅色，有充滿胞漿粗大顆粒血液細(xì)胞組織化學(xué)第46頁計(jì)算積分分?jǐn)?shù)細(xì)胞數(shù)目積分0200145452255035154520總數(shù)100130=LAP積分

血液細(xì)胞組織化學(xué)第47頁臨床意義

正常LAP積分是20－100分，但因?yàn)橛?jì)數(shù)主觀性，很主要是建立每個(gè)試驗(yàn)室自己正常值。臨床診療積分正常20－100CML＜13類白血病＞100真紅100－200繼發(fā)性紅細(xì)胞增多10－100

血液細(xì)胞組織化學(xué)第48頁血液細(xì)胞組織化學(xué)第49頁鐵粒染色血液細(xì)胞組織化學(xué)第50頁原理

骨髓小粒中含鐵血黃素稱細(xì)胞外鐵，其中三價(jià)鐵與分子中蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離出來，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍(lán)反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。依據(jù)反應(yīng)強(qiáng)弱了解骨髓中鐵含量。

血液細(xì)胞組織化學(xué)第51頁試劑

酸性亞鐵氰化鉀溶液：200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩加入濃鹽酸，邊滴加邊搖勻，至出現(xiàn)白色沉淀，再滴加200g/L亞鐵氰化鉀，邊滴加邊搖勻，至白色沉淀消失為止，備用。2g/L核固紅－硫酸鋁溶液：取硫酸鋁10g加入100mlDH2O再加入核固紅EMER出品0.2g，置于37℃水浴中1小時(shí)，并經(jīng)常振蕩，使溶解，過濾后使用。血液細(xì)胞組織化學(xué)第52頁方法選骨髓小粒豐富骨髓涂片玻