免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第1頁實(shí)驗(yàn)要求與實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

試驗(yàn)課要求：

1.課前預(yù)習(xí)，明確目標(biāo)，了解試驗(yàn)內(nèi)容與方法。閱讀試驗(yàn)指導(dǎo)

2.試驗(yàn)過程嚴(yán)厲認(rèn)真，按試驗(yàn)規(guī)程操作，要有嚴(yán)格科學(xué)態(tài)度

3.仔細(xì)觀察如實(shí)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果，按時(shí)獨(dú)立完成試驗(yàn)匯報(bào)

試驗(yàn)室規(guī)則：

1.進(jìn)入試驗(yàn)室必須穿整齊隔離衣，禁止在試驗(yàn)室內(nèi)高聲喧嘩

2.禁止在試驗(yàn)室內(nèi)飲食，吸煙和做與試驗(yàn)無關(guān)其它事情

3.節(jié)約試驗(yàn)用具，愛護(hù)儀器設(shè)備，如有損壞及時(shí)匯報(bào)老師

4.強(qiáng)化安全意識(shí)，注意水電安全。值日小組認(rèn)真整理衛(wèi)生，保持試驗(yàn)臺(tái)面清潔整齊，試驗(yàn)廢物放入指定垃圾桶內(nèi)。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第2頁臨床免疫學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)第一個(gè)別抗原抗體反應(yīng)（Antigen-AntibodyReaction）抗原抗體反應(yīng)概念：是指對應(yīng)抗原-抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。主要應(yīng)用：

1.用已知抗原檢測未知抗體，抗體效價(jià)

2.用已知抗體檢測未知抗原，明確病原生物抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)常見試驗(yàn)方法：

◆凝集反應(yīng)◆沉淀反應(yīng)◆補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)◆免疫標(biāo)識(shí)試驗(yàn)技術(shù)試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：掌握抗原抗體結(jié)合反應(yīng)原理，方法及其應(yīng)用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第3頁第一節(jié)凝集反應(yīng)（Agglutination）

反應(yīng)原理：

顆粒型抗原與對應(yīng)抗體在電解質(zhì)溶液中出現(xiàn)凝集想象凝集反應(yīng)方法：

直接凝集：顆粒性抗原和對應(yīng)抗體直接出現(xiàn)凝集反應(yīng)

間接凝集：先將可溶性抗原吸附于大分子顆粒載體表面,再與對應(yīng)抗體結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)。

詳細(xì)試驗(yàn)內(nèi)容與方法：◆玻片凝集試驗(yàn)：傷寒沙門氏菌與痢疾志賀式菌檢測，用已知抗血清檢測患者體內(nèi)未知抗原。操作見試驗(yàn)指導(dǎo)◆試管凝集試驗(yàn)（微量反應(yīng)板法）：用已知顆粒性抗原與被檢血清混合，然后觀察試管內(nèi)有沒有凝集，并觀察血清凝集效價(jià)，判斷抗體濃度。◆間接凝集試驗(yàn)（類風(fēng)濕因子檢測RF）：屬本身免疫性疾病

受外界刺激，機(jī)體IgG變性，產(chǎn)生抗原性（RF），刺激本身產(chǎn)生抗變性

IgG抗體，此抗體與RF因子結(jié)合形成免疫復(fù)合物沉積于病變部位。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第4頁抗原抗體反應(yīng)示意圖

NaCl可見反應(yīng)直接凝集反應(yīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第5頁

定義：凝集反應(yīng)指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或表面覆蓋抗原顆粒狀物質(zhì)(如紅細(xì)胞、聚苯乙烯膠乳等)，與對應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，形成肉眼可見凝集團(tuán)塊現(xiàn)象。試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：掌握抗原抗體結(jié)合反應(yīng)原理，方法及其應(yīng)用

屬免疫學(xué)最簡單最直接最常見基礎(chǔ)試驗(yàn)試驗(yàn)一凝集反應(yīng)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第6頁用已知抗血清檢測被檢樣品中有沒有相對應(yīng)抗原免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第7頁【試驗(yàn)內(nèi)容】

玻片凝集：常見已知抗血清檢測未知抗原，定性

試管凝集：可檢測未知抗原或抗體并能匯報(bào)凝集效價(jià)

一、玻片凝集反應(yīng)（定義）

當(dāng)顆粒性抗原與對應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合時(shí)，二者

百分比適宜，在電解質(zhì)溶液中展現(xiàn)肉眼可見顆粒狀

凝集，此現(xiàn)象稱凝集反應(yīng)。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第8頁【試驗(yàn)材料】1.1:20痢疾免疫血清，1:20傷寒免疫血清。2.傷寒沙門菌菌液，痢疾志賀菌菌液。3.生理鹽水，玻片，微量移液器，消毒缸等。一、玻片凝集反應(yīng)

12取清潔玻片兩張，用記號(hào)筆，玻璃蠟筆作出標(biāo)識(shí)和畫好分區(qū)，按試驗(yàn)指導(dǎo)要求加樣操作。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第9頁

【方法】

1.取潔凈玻片2張，各用記號(hào)筆劃分三等份。

2.在玻片左上角分別標(biāo)識(shí)1和2。

3.按以下要求依次加入反應(yīng)物。各種加量均為20微升

4.轉(zhuǎn)動(dòng)玻片，充分混勻1-2min后觀察反應(yīng)結(jié)果并作出解釋。解釋說明出現(xiàn)凝集和不出現(xiàn)凝集依據(jù)?！瘛瘛瘛?/p>

1

2

生理1：20傷1：20痢鹽水血清血清

+++

傷寒沙傷寒沙傷寒沙門菌門菌門菌

生理1：20傷1：20痢鹽水血清血清

+++

痢疾志痢疾志痢疾志賀菌賀菌賀菌免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第10頁

二、試管凝集反應(yīng)

【試驗(yàn)原理】

將待檢血清作對倍稀釋后，加入等量已知顆粒性抗原與待檢血清混合，抗原與不一樣稀釋度抗體在試管內(nèi)直接結(jié)合而出現(xiàn)凝集現(xiàn)象稱為試管凝集反應(yīng)。此法是一個(gè)半定量法。常見已知抗原(如細(xì)菌懸液，RBC懸液)來測定被檢血清中對應(yīng)抗體水平(效價(jià)或滴度)。用于檢測被檢血清中是否存在和已知抗原對應(yīng)抗體及抗體效價(jià)：如；患者血清中免疫性抗體檢測。

比如孕婦血清中免疫性IgG檢測，用于新生兒溶血病診療、病毒感染后，患者抗病毒抗體產(chǎn)生情況觀察免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第11頁【材料】1．1:20傷寒免疫血清。

2．傷寒沙門菌菌液，甲型副傷寒沙門菌菌液。

3．生理鹽水，TIP頭，微量移液器，

4.U型微量反應(yīng)板。見下列圖

5．恒溫培養(yǎng)箱等。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第12頁方法:

取U型微量反應(yīng)板，做好標(biāo)識(shí)，加樣

小心加樣！取U型微量反應(yīng)板（做好個(gè)人或小組標(biāo)識(shí)）于兩橫排1～10孔中各加入生理鹽水每孔50μl。分別在兩橫排第1孔內(nèi)加入1:20傷寒免疫血清50μl，每排各從第1孔開始作對倍稀釋至第9孔，從第9孔混勻后棄去50μl。第一橫排從第10孔至第1孔各加入傷寒沙門菌菌液50μl/孔第二橫排同法各加入甲型副傷寒沙門菌菌液50μl/孔。充分混勻后，置45℃恒溫箱孵育1h后取出。室溫靜置15min，最好在黑色背景下，觀察并匯報(bào)結(jié)果。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第13頁

血清對倍稀釋方法：

用微量移液器將第1孔溶液連續(xù)吸吹三次，使其充分混勻。吸出50μl移入第2孔。同法吸吹三次使充分混勻后再吸出50μl移入第3孔，如此作對倍稀釋至第9孔，吸吹混勻后吸出50μl棄去。此時(shí)第1～9孔血清稀釋度依次增加一倍，即血清對倍稀釋法或倍比稀釋法。注意：做倍比稀釋吸收時(shí)插到管底，吹出時(shí)離開液面，沿孔壁吹出。動(dòng)作要連續(xù)輕巧，切勿犯錯(cuò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第14頁

孔號(hào)

12345678910

生理鹽水（μl）

505050505050505050501:20傷寒

505050505050505050—

免疫血清（μl）（棄去50）血清稀釋度

1:401:801:160------------------------------1:10240—

菌液（μl）

50505050505050505050血清最終

1:801:1601:320-----------------------------1:20480—

充分混勻后，置45℃孵育1h，取出室溫靜置15min觀察結(jié)果試管凝集試驗(yàn)操作與稀釋圖示

第一排：每孔加入傷寒沙門菌菌液50μl。菌液要充分混勻！第二排：每孔加入甲型副傷寒沙門菌菌液50μl

。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第15頁

【結(jié)果觀察與判定】

觀察結(jié)果：先觀察生理鹽水陰性對照孔（10空）

此孔不發(fā)生凝集，呈混懸菌液。液體混濁，管底沉淀物呈圓形，邊緣整齊。此沉淀物是在靜置過程中細(xì)菌因重力作用自然下沉形成。輕輕搖動(dòng)呈混懸液。

然后自第1孔開始依次觀察孔內(nèi)液體混濁程度及孔底凝集塊大小。

以出現(xiàn)顯著凝集（＋＋）管號(hào)血清滴度匯報(bào)結(jié)果如：4孔+++，5孔++，6孔+。則匯報(bào)為：1：640免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第16頁

凝集物上清液凝集程度全部凝集澄清透明++++（凝集塊大，為最強(qiáng)凝集）大部份凝集基礎(chǔ)透明+++（凝集塊較大，為強(qiáng)凝集）有顯著凝集半透明++（凝集塊顯著，為中度凝集）極少凝集基礎(chǔ)混濁+（凝集塊不顯著，為弱凝集）不凝集混濁-

（未見凝集塊，為不凝集）++++++++++-

強(qiáng)凝集顯著凝集弱凝集免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第17頁凝集效價(jià)判定1.觀察第一排1-9管凝集情況，作出判定：凝集效價(jià)（血清凝集滴度）判定：以能與一定量抗原發(fā)生肉眼可見顯著凝集（++）血清最高稀釋度結(jié)果匯報(bào)：凝集效價(jià)1∶XXXX

2.觀察第二排1-10管反應(yīng)情況，并作出解釋免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)磻?yīng)第18頁復(fù)習(xí)思索題？

1.依據(jù)你試驗(yàn)結(jié)果說明抗原抗體反應(yīng)特異性。2.何謂血清凝集效價(jià)（滴