人造血干細(xì)胞擴(kuò)增的研究進(jìn)展

人造血干細(xì)胞擴(kuò)增的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞：干細(xì)胞人造血

progressonStudyofTechniquesforExpansionofHumanHematopoieticStemCells

造血干細(xì)胞移植可能使遺傳血液病、免疫缺陷病及惡性腫瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴為獲得足夠量移植用HSC，必須進(jìn)行大規(guī)模的骨髓抽吸或餐周血分離；⑵獲得的HSC量有限；⑶HSC輸注后產(chǎn)生的成熟細(xì)胞的生物動力欠佳，移植后1-3周內(nèi)并無直接治療療效。移植前HSC培養(yǎng)擴(kuò)增，可解決這些難題。當(dāng)前主要有兩種：⑴細(xì)胞因子支持下篩選CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增；⑵基質(zhì)支持下的灌注培養(yǎng)。下面就HSC培養(yǎng)的發(fā)展、HSC擴(kuò)增方法以及展望等作一綜述。

1早期HSC培養(yǎng)及啟示

1半固體培養(yǎng)體系1966年，Bradley等[1]介紹了一種新的半固體培養(yǎng)方法用以培養(yǎng)骨髓。此法利用膠體凝膠作支托，沒有細(xì)胞微環(huán)境，只能維持造血祖細(xì)胞在1-2周內(nèi)形成細(xì)胞集落，不能支持HSC的生長或分化。即使沒法加入營養(yǎng)物、生長因子等，培養(yǎng)時(shí)間也只能延長到2-4周。由半固體培養(yǎng)體系的期限性可推斷，早期原始HSC不能在這樣的培養(yǎng)體系中存活、增殖。

2Dexter培養(yǎng)體系Dexter等于1977年建立了骨髓液體培養(yǎng)體系。此培養(yǎng)法基礎(chǔ)是建立一骨髓基質(zhì)細(xì)胞支持層，形成二維空間結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)體系不單提供了營養(yǎng)、細(xì)胞因子，而且提供了類似于體內(nèi)的細(xì)胞-細(xì)胞關(guān)系，使此法纖維造血8-12周。極限稀釋法技術(shù)證明，在Dexter培養(yǎng)體系中，前造血祖細(xì)胞在培養(yǎng)第一周前已開始減少。應(yīng)用細(xì)胞免疫表型分析提示，該體系培養(yǎng)的骨髓CD34+、CD38-細(xì)胞不能更新復(fù)制。早期造血細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增方法的研究啟示：HSC細(xì)胞可在體外培養(yǎng)，但兩種培養(yǎng)方法均沒有建立適合其體外造血的微環(huán)境。尋求建立，一個(gè)合適的人HSC培養(yǎng)體系是研究的關(guān)鍵。

2目前HSC的體外擴(kuò)增方法

理想的SHC培養(yǎng)方法要求既能最大限度地?cái)U(kuò)增各階段的造血細(xì)胞，又能維持甚至擴(kuò)增HSC。目前較為成功的人HSC體外擴(kuò)增方法主要有兩種：⑴細(xì)胞因子支持十篩選CD34+細(xì)胞的體外擴(kuò)增；⑵基質(zhì)支持下的灌注培養(yǎng)。

細(xì)胞因子支持下篩選CD34+細(xì)胞培養(yǎng)

HSC的特性HSC沒有任何形態(tài)方面的特征，也沒有獨(dú)特的免疫表型迄今尚無直接檢測的方法。HSC只能通過脾結(jié)節(jié)形成法檢測，也可通過檢測高增殖潛能集落形成單位長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123熒光呈陰性或低強(qiáng)度，對4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的細(xì)胞群體，早期的造血細(xì)胞大部分處于G0/G1期，啟動慢，但擴(kuò)增持續(xù)時(shí)間長，擴(kuò)增倍數(shù)高，造血細(xì)胞產(chǎn)量高。較成熟造血細(xì)胞啟動快，短期擴(kuò)增倍數(shù)高，維持時(shí)間短，產(chǎn)物多是成熟細(xì)胞，造血祖細(xì)胞產(chǎn)量少。

細(xì)胞因子的造血調(diào)節(jié)根據(jù)細(xì)胞因子對造血細(xì)胞不同的作用階段將其分為：⑴特異性細(xì)胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；⑵無系特異性細(xì)胞因子：作用于分化狀態(tài)的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要維持處于G0期之外所有HSC的生存、增生；⑶G0期作用細(xì)胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，維持早期HSC的存活或促其分化擴(kuò)增：⑷抑制血細(xì)胞生成的細(xì)胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特異性，TGF-β主要抑制早期血細(xì)胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖。

擴(kuò)增策略目前細(xì)胞因子支持下篩選CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增方法研究最為普遍。實(shí)驗(yàn)證明，篩選早期HSC剔除成熟的CD34-細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得更好的效果。單獨(dú)應(yīng)用一個(gè)細(xì)胞因子擴(kuò)增人HSC效果不佳，多個(gè)因子合理組合才能獲得理想的擴(kuò)增效果。一般認(rèn)為，生長因子合理組合應(yīng)包括：⑴抑制細(xì)胞殘死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等⑵刺激早期造血細(xì)胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；⑶定向擴(kuò)增刺激因子，如G-CSF和EPO等。

Moore[10]用delta培養(yǎng)法培養(yǎng)骨髓CD34+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)未用因子時(shí)CFU-GM迅速消失；而單用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子時(shí)，14天培養(yǎng)CFU-GM維持不變或只擴(kuò)增2-8倍；用SCF/IL-3聯(lián)用另3個(gè)或3個(gè)以上因子組合擴(kuò)增效果更好。多數(shù)人認(rèn)為合適的細(xì)胞因子組合為IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17擴(kuò)增經(jīng)動員外周血CD34+細(xì)胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以擴(kuò)增非MPBCD34+細(xì)胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]則認(rèn)為SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最適于外周血CD34+細(xì)胞擴(kuò)增，12-14天培養(yǎng)，擴(kuò)增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而擴(kuò)增臍血CD34+、CD45RAlow、CD77low的CFU-GM和BFU-E的最好因子組合分別為SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，擴(kuò)增兩者的最佳組合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分無IL-6R表達(dá)，IL-6/Sil-6R復(fù)合體激發(fā)HSC表達(dá)gp130，啟動HSC自我復(fù)制的信號傳遞，而c-Kit/SCF是HSC自我自制擴(kuò)增的另一信號傳遞途徑。無血清條件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人臍血CD34+細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)和造血祖細(xì)胞數(shù)隨Sil-6R增加而明顯增加，培養(yǎng)14天，

CFU-GM擴(kuò)增近70倍，集落中除了幾個(gè)CFU-M和BFU-E外，有大量的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情況下，培養(yǎng)7天，14天，分別擴(kuò)增CFU-Mix60倍和70倍。由此說明，細(xì)胞因子促進(jìn)造血是通過與期受體結(jié)合引起信號傳遞而起作用的，為體外造血研究開創(chuàng)了新的思路。

細(xì)胞因子支持下篩選CD34+細(xì)胞擴(kuò)增法有以下優(yōu)越性：⑴條件容易控制，產(chǎn)量穩(wěn)定；⑵無異體基因污染。缺點(diǎn)是：目前還無可完全代替基質(zhì)的細(xì)胞因子，單用因子不能維持體外長期造血；需不斷加入因子，費(fèi)用昂貴，不能大規(guī)模使用。

基質(zhì)細(xì)胞支持的灌注培養(yǎng)

此培養(yǎng)方法提供HSC一個(gè)接近于體內(nèi)的造血環(huán)境，能擴(kuò)增各階段的造血細(xì)胞，并維持甚至擴(kuò)增原始HSC，稱原始HSC培養(yǎng)方法。

基質(zhì)支持作用此作用除了通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸的直接作用外，還分泌許多因子影響造血過程。骨髓基質(zhì)是最常用的造血支持層來源，包括基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)以及多種造血生長因子調(diào)節(jié)HSC的造血動力學(xué)。用作造血支持的基質(zhì)細(xì)胞除骨髓外還包括其它許多來源的細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞與HSC可以同基因或異基因、同種或異種。此外，還建立了許多轉(zhuǎn)化的基質(zhì)細(xì)胞系，用于造血支持。經(jīng)過轉(zhuǎn)化的基質(zhì)細(xì)胞系具有分泌細(xì)胞因子的功能，加強(qiáng)造血調(diào)控。Otsukat等[16]報(bào)道，在長期培養(yǎng)體系中，以基因工程改造的成纖維細(xì)胞為支持細(xì)胞，使之分泌GM-CSF、G-CSF和IL-3因子，相同濃度下，這些因子對HSC增殖有更強(qiáng)的刺激作用。

直接比較基質(zhì)支持培養(yǎng)和細(xì)胞因子支持培養(yǎng)的擴(kuò)增效果顯示，目前可能用到的任何細(xì)胞因子都無法完全代替基質(zhì)細(xì)胞的支持作用。因子培養(yǎng)結(jié)果，原始HSC常常減少，而只有基質(zhì)支持的培養(yǎng)可使原始HSC維持不減甚至擴(kuò)增[17，18]。有實(shí)驗(yàn)顯示，骨髓的LTC-IC在細(xì)胞因子支持下培養(yǎng)只維持35%的啟始量，而基質(zhì)細(xì)胞卻能令其擴(kuò)增5倍[16]。臍血LTC-IC在因子作用下培養(yǎng)7天，擴(kuò)增2-7倍，培養(yǎng)14天，擴(kuò)增2-3倍，而基質(zhì)細(xì)胞卻可達(dá)加倍的擴(kuò)增效果[19]。用微孔網(wǎng)把HSC和基質(zhì)隔開稱基質(zhì)非接觸共培養(yǎng)，近期文獻(xiàn)認(rèn)為，HSC與基質(zhì)接觸與否并不影響增殖分化[20]。相反，非接觸可部分地使HSC與產(chǎn)生增殖負(fù)性細(xì)胞因子信號的隔開，減輕造血受抑。

造血生長因子支持作用。基質(zhì)支持灌注培養(yǎng)常加用因子，以加強(qiáng)HSC的擴(kuò)增效果。因子一方面支持基質(zhì)細(xì)胞，起間接造血作用，一方面直接刺激HSC存活、增殖、分化。Koller等[18]在生物反應(yīng)系統(tǒng)中，加入IL-3/IL-6/SCF培養(yǎng)臍血單個(gè)核細(xì)胞，15天培養(yǎng)擴(kuò)增CFU-GM11倍、5天倍、3天倍及5天LTC-IC3個(gè)樣品中2個(gè)擴(kuò)增3倍。他的另一實(shí)驗(yàn)，基質(zhì)細(xì)胞支持培養(yǎng)不同純度的人骨髓CD34+細(xì)胞，采用多種因子組合比較，以IL-3/IL-6/SCF/EPO及IL-3/GM-CSF/SCF/EPO擴(kuò)增效果最佳，細(xì)胞、祖細(xì)胞數(shù)明顯增加，而且維持LTC-IC不減[17]。

介質(zhì)灌注作用介質(zhì)灌注是影響HSC培養(yǎng)的又一重要因素。介質(zhì)灌注可以保證營養(yǎng)、細(xì)胞因子等供應(yīng)，清除有造血抑制代謝產(chǎn)生，刺激基質(zhì)細(xì)胞分泌因子[21]。控制適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)灌注，顯著地提高體外造血的效率。已知，體內(nèi)組織細(xì)胞細(xì)胞密度為5×108·ml-1的漿灌注為·kg-1·min-1，相當(dāng)于細(xì)胞密度為106·ml-1，含20%血清的培養(yǎng)介質(zhì)，每天全部更換一次。Schwartz等[22]按7V·W-1，·W-1和1V·W-1換液培養(yǎng)低密度的骨髓MNC，發(fā)現(xiàn)·W-1換液效果最好，可維持造血20周。整個(gè)過程，細(xì)胞產(chǎn)量傳統(tǒng)Dexter培養(yǎng)法的3倍，而且維持祖細(xì)胞穩(wěn)定生產(chǎn)直到18周，在已報(bào)道文獻(xiàn)中，造血維持時(shí)間最長。Plasson等也發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果。

氧濃度的影響Koller等認(rèn)為5%低氧化正常20%氧濃度更能刺激造血，實(shí)驗(yàn)見CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM分別擴(kuò)增12倍、3倍和4倍。此外，延長祖細(xì)胞維持時(shí)間1-2周。而Palson等的實(shí)驗(yàn)則顯示20%o2最利于體外造血，40%O2次之，5%及60%O2最差。

生物反應(yīng)器作用有人通過改進(jìn)反應(yīng)器提高HSC擴(kuò)增效果。如Davis等[26]利用人造血毛細(xì)血管系統(tǒng)用豬內(nèi)皮細(xì)胞支持培養(yǎng)骨髓CD34+細(xì)胞、培養(yǎng)18天，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增150倍、CFU-GM1600倍、CFU-Blast77倍，效果特點(diǎn)顯著。應(yīng)用該體系，造血祖細(xì)胞及早期造血細(xì)胞均獲相當(dāng)高的擴(kuò)增，似乎找到HSC擴(kuò)增的真諦。

培養(yǎng)啟始HSC純度影響低純化或不純化MNC灌注培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：⑴保存盡量多的CD34+輔助細(xì)胞；⑵大量的基質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可形成支持層；⑶減少篩選過程對HSC破壞。Koller等用不同純度的CD34+LIN-細(xì)胞灌注培養(yǎng)，證明CD34+LIN-細(xì)胞純度越低，擴(kuò)增細(xì)胞、CFU-GM和LTC-IC倍數(shù)越高，而以后兩種最受影響。

其它細(xì)胞接種密度和收獲時(shí)機(jī)對HSC擴(kuò)增效果有一定影響。粘附因子介導(dǎo)HSC和基質(zhì)細(xì)胞的接觸刺激HSC增殖分化，也是不可忽視的因素。

基質(zhì)細(xì)胞支持下灌注培養(yǎng)有如下優(yōu)點(diǎn)：⑴維持造血時(shí)間長達(dá)數(shù)月；⑵可維持LTC-IC不減甚至擴(kuò)增；⑶細(xì)胞因子應(yīng)用少，費(fèi)用低；⑷擴(kuò)增前無太多的處理，保持HSC的活性，避免去除輔助細(xì)胞。缺點(diǎn)是條件不易控制，產(chǎn)物不穩(wěn)定。

3展望

由于目前對HSC的特性尚未透徹了解，所以HSC體外擴(kuò)增要獲得不同階段的細(xì)胞大量增殖，同時(shí)擴(kuò)增原始細(xì)胞量遇到困難。以后研究可以主要集中于以下幾個(gè)方面。

HSC增殖分化的調(diào)控基因研究在分子水平和基因水平把握造血的的機(jī)制，指導(dǎo)體外HSC的培養(yǎng)，HSC逐漸分化，喪失自我更新的能力，可有由于基因易位和重排所致。若然如此，通過基因重新復(fù)位，可使一個(gè)已經(jīng)分化的細(xì)胞返祖為HSC。在此領(lǐng)域研究信號傳導(dǎo)機(jī)制，可以在關(guān)鍵點(diǎn)阻斷HSC分化信號傳導(dǎo)，而加強(qiáng)自我更新信號傳導(dǎo)，提高HSC的擴(kuò)增。

新的造血生長因子的發(fā)現(xiàn)，目前所用的造血生長因子均無法代替基質(zhì)細(xì)胞的作用，說明仍存在某種未知的關(guān)鍵造血調(diào)控因子。致力于新的造血生長因子發(fā)現(xiàn)，將對改善HSC培養(yǎng)起巨大作用。

定向細(xì)胞培養(yǎng)使HSC向某一系定向增殖是HSC培養(yǎng)的新方向。針對臨床不同需要，選擇性擴(kuò)增紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞等具有廣闊的應(yīng)用前景。

可以相信，隨著細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，對HSC了解會更加明了，HSC的擴(kuò)增會逐步完善。HSC擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展將為血液系統(tǒng)疾病、腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供充足的材料和新的技術(shù)方法。

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