中草藥有效成分對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究進(jìn)展

中草藥有效成分對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究進(jìn)展

在凋亡的概念引進(jìn)之前，抗癌藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制一直被認(rèn)為是通過影響細(xì)胞增殖周期的不同時(shí)相，從而最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的壞死。事實(shí)上，腫瘤細(xì)胞的死亡可以通過凋亡和壞死兩個(gè)途徑。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。越來越多的研究證實(shí)，許多中草藥具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本文試從凋亡概念的形成、凋亡的機(jī)制、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對凋亡的檢測手段、以及中草藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展作一綜述。

1現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)學(xué)對腫瘤細(xì)胞凋亡的認(rèn)識

1965年發(fā)育生物學(xué)家Lockshin和Willianms首先提出了PCD(ProgrammedCellDeath，程序化細(xì)胞死亡)一詞，用于描述蛾幼蟲的生理性死亡。1972年Kerr等從形態(tài)學(xué)的角度描述細(xì)胞的生理死亡，并將這種細(xì)胞死亡命名為凋亡(apoptosis)［1］。細(xì)胞凋亡又稱程序性死亡(PCD)。細(xì)胞凋亡為形態(tài)術(shù)語，程序性死亡為功能術(shù)語［2］，目前文獻(xiàn)中多傾向于細(xì)胞凋亡這一術(shù)語，認(rèn)為這種死亡是因外來因素觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)在的死亡機(jī)制，最終導(dǎo)致了細(xì)胞自身的死亡。外來因素可能是生理性的，也可能是非生理性的，在組織中凋亡的發(fā)生是不同步的。

在體內(nèi)，凋亡小體一旦形成就被臨近的上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞吞噬，并在溶酶體內(nèi)被降解。這一過程中沒有細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，不引起炎癥反應(yīng)，同壞死有明顯的區(qū)別。凋亡和壞死可以認(rèn)為是細(xì)胞死亡的兩個(gè)不同的途徑［3，4］。通過相差顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞從發(fā)生凋亡，到形成凋亡小體，整個(gè)過程在幾分鐘內(nèi)完成［5］。凋亡不但存在于正常組織，也存在于腫瘤組織。目前大多數(shù)人認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控的結(jié)果，也可能是由于細(xì)胞凋亡受阻，或者說是應(yīng)該發(fā)生凋亡的細(xì)胞群未發(fā)生凋亡的結(jié)果。但是研究也發(fā)現(xiàn)許多未經(jīng)治療的腫瘤組織中存在著自發(fā)性的細(xì)胞凋亡，推測其機(jī)制可能和腫瘤組織的輕度缺血，細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞釋放TNFα及內(nèi)在的凋亡機(jī)制被啟動等有關(guān)［6］。

近年來的研究表明，在控制腫瘤的生長和調(diào)節(jié)腫瘤對各種治療如放療和化療的反應(yīng)中，凋亡都充當(dāng)重要的角色。藥物治療達(dá)到一定的劑量可引起腫瘤細(xì)胞壞死，而當(dāng)刺激水平降低時(shí)，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。一些中藥的有效成分可以引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是其機(jī)制尚不清楚。此外，凋亡凋控在分子水平上的發(fā)展，尤其發(fā)現(xiàn)凋亡受到特定原癌基因的蛋白產(chǎn)物及某些抑癌基因產(chǎn)物等的調(diào)控，大大擴(kuò)展了其在腫瘤學(xué)研究上的意義［7～13］。

2腫瘤細(xì)胞凋亡的常用檢測方法

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

透射電鏡下的凋亡細(xì)胞最具特征性。如腫瘤細(xì)胞的體積變小，胞膜突起，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)仍然保留，核染色質(zhì)呈塊狀沿核模濃聚，胞漿空泡增多，后期細(xì)胞DNA斷裂，形成由膜包裹的內(nèi)有較完整的細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片的凋亡小體。掃描電鏡顯示凋亡細(xì)胞體積縮小，微絨毛和偽足減少或消失。可見部分細(xì)胞表面出現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)泡狀突起。突起常位于細(xì)胞的一側(cè)，且大小不等，有的球形小體與胞體間連接變窄。

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

由于凋亡的腫瘤細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的激活，染色質(zhì)DNA在核小體間斷裂，降解成約180~200bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，通過電泳后在UV燈下呈現(xiàn)經(jīng)典的DNA梯狀帶。

流式細(xì)胞儀檢測

流式細(xì)胞儀檢測的原理是根據(jù)凋亡細(xì)胞在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上發(fā)生的特征性改變。其中核的改變最具特征性，在流式細(xì)胞儀光度計(jì)上呈現(xiàn)明顯的亞二倍體核型峰的特征。

DNA缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)

TUNEL鑒定可以檢測凋亡細(xì)胞核中的單股和雙股DNA斷鏈。原理是TdT酶將外源性的生物素或地高辛標(biāo)記的dUTP直接連接到凋亡細(xì)胞核的DNA斷鏈的末端。該方法靈敏度高，可直接在光鏡下觀察，可進(jìn)行定量分析，較適用于石蠟組織切片的測定，因而被廣泛應(yīng)用［14］。但是細(xì)胞壞死晚期DNA也被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn)TUNEL標(biāo)記陽性，所以此法也有其局限性［15］。

3中藥誘導(dǎo)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對中草藥的研究采取了現(xiàn)代化的手段，發(fā)現(xiàn)了中藥的某些有效成分及有效組分，并能完成有效成分的分離提取。如人參皂甙、三七甙、仙靈多糖、中藥中齊墩果酸、黃芪多糖、云芝多糖、豬苓多糖等具有增強(qiáng)和激活免疫系統(tǒng)功能的作用，有助于機(jī)體發(fā)揮自身的抗癌作用。中藥山慈姑是秋水仙堿的原型藥，長春花堿、長春新堿及喜樹堿、羥基喜樹堿、三尖杉酯堿、半支蓮生物堿等均是從中藥長春花、喜樹果、三尖杉、半支蓮等中提煉出來的生物堿，臨床上廣泛應(yīng)用這些含有抗癌成分的中藥治療腫瘤，收到了一定療效。并且許多上述這些有效成分經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［16～２０］。

中藥或中西醫(yī)結(jié)合能有效治療惡性腫瘤，同時(shí)能減輕放化療的毒副作用，已經(jīng)為大量的臨床實(shí)踐證明。大量的研究發(fā)現(xiàn)，一些從中藥中提取的生物堿，如漢防已堿、秋水仙堿、華木防己堿，以及小襞胺等能有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長。深入研究發(fā)現(xiàn)，這些生物堿不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，還有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。此外，對某些臨床上運(yùn)用較多的抗癌中藥方劑，如活血化淤、解毒消腫類方劑的研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物也有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［21，22］。

一些中藥單方或復(fù)方可通過提高機(jī)體免疫力達(dá)到間接殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。根據(jù)中醫(yī)理論則是通過扶正固本來達(dá)到“驅(qū)邪”的目的。實(shí)驗(yàn)證明，蟲藥香菇多糖，蟲草多糖等能誘生TNF［17］，小柴胡湯，十全大補(bǔ)湯及其中部分中藥如柴胡、當(dāng)歸、桂枝、茯苓等均具有誘生TNF、提高TNF活性的能力［18］。而TNF則可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

由于國內(nèi)外70年代起采用砷劑治療白血病取得了喜人的進(jìn)展，近年來對一些有確切療效的含砷中藥制劑及其有效成分的誘導(dǎo)凋亡能力進(jìn)行了廣泛研究。如在民間驗(yàn)方的基礎(chǔ)上開發(fā)的“癌靈1號(主要含砒霜)”［19］，含硫化砷的中藥復(fù)方青黛片［20］等在治療慢性粒細(xì)胞白血病或急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了喜人的效果。陳氏［23］研究發(fā)現(xiàn)，氧化砷具有特異性地誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞NB4凋亡的能力。其機(jī)制是通過下調(diào)bcl2基因表達(dá)，使bcl2/bax比值減少，從而導(dǎo)致氧化砷誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，而氧化砷并不影響bax，

bclx，cmyc和p53基因的表達(dá)。此外，研究亦證實(shí)了三氧化二砷還能快速有效地誘導(dǎo)原代APL(急性早幼粒細(xì)胞性白血病)細(xì)胞凋亡［24，25］。

莪術(shù)是具有活血化淤功能的常用抗癌中草藥之一，姜科屬植物，性苦辛溫，常用于方劑中治療肝癌、胃癌、白血病、宮頸癌。近年來國內(nèi)外對其提取物的研究較多。如BhaumikS等［26，27］研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)提取物姜黃可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的了AK5腫瘤細(xì)胞(一種大鼠的組織細(xì)胞瘤模型)凋亡，從而抑制AK5腫瘤細(xì)胞的生長。KawamoriT等［28］則用姜黃處理雄性F344大鼠的結(jié)腸癌模型以研究其對腫瘤模型的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃能明顯提高腫瘤細(xì)胞的凋亡比例。

4中藥方劑血清藥理學(xué)方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究

中藥方劑具有“天然組合化學(xué)庫”之稱，其作用機(jī)理可能是多靶作用，即復(fù)方中多種有效成分以低于它們中某一單味治療量進(jìn)入人體后，有選擇地反復(fù)作用于某種疾病的多個(gè)直接靶點(diǎn)(治標(biāo))和間接靶點(diǎn)(治本)，從而達(dá)到治療疾病的目的［29］。

血清藥理學(xué)方法是一種研究方法，實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而不是一門學(xué)科。其原理是將中藥復(fù)方制劑通過動物灌胃或人體(健康志愿者)服用，經(jīng)吸收進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)，在達(dá)到一定血藥濃度后，收集受試動物或人的血液，分離所得血清(血清內(nèi)含有一定量的該藥物成分)，再將此血清加入到體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，觀察其藥理作用、分析其所含藥物有效成分。此時(shí)的血藥濃度反映了機(jī)體的真實(shí)血藥濃度。它可排除在體外實(shí)驗(yàn)中各種干擾因素

影響，比較接近藥物的體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程，避免體外實(shí)驗(yàn)得出的錯(cuò)誤結(jié)論［30］。

楊氏等［21］選用具有化痰散結(jié)、活血化淤作用的含蜈蚣、蟾皮、半夏、天南星、三七等的892中藥方劑，給純種新西蘭家兔灌胃，通過血清藥理學(xué)方法成功地誘導(dǎo)了人肝癌細(xì)胞的凋亡，在熒光鏡下明顯出現(xiàn)核碎裂的凋亡小體。證明中藥復(fù)方亦具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，而且這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用可以經(jīng)口服藥物在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。何氏［22］等選用含白英、山慈姑、茱苓、蜈蚣、延胡索等7味中藥構(gòu)成的中藥復(fù)方1號及含白花蛇舌草、莪術(shù)、夏枯草、半邊蓮等6味中藥構(gòu)成的中藥2號方劑，分別給純種新西蘭家兔灌胃，取血清誘導(dǎo)培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1號方劑誘導(dǎo)后的培養(yǎng)細(xì)胞，無論是DNA凝膠電泳分析、透射電鏡觀察、或是流式細(xì)胞分析都發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的特征。

總之，血清藥理學(xué)的方法比中藥粗提物直接體外實(shí)驗(yàn)有明顯的優(yōu)勢，能夠揭示單一中藥或者復(fù)方在體內(nèi)代謝過程中活性成分的轉(zhuǎn)化和改變；從而有助于研究中藥復(fù)方配伍規(guī)律和促進(jìn)中藥復(fù)方藥代動力學(xué)研究的深入開展；有助于中藥中真正有效部位、活性成分的發(fā)現(xiàn)，為新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

5展望

中草藥有效成分對腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究仍處于初步階段。有待進(jìn)一步研究的問題主要有：(1)目前中草藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡多為體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)情況相當(dāng)復(fù)雜。如有些中藥的有效成分可直接誘導(dǎo)凋亡，有些中藥需要通過體內(nèi)的代謝才能發(fā)揮作用，有些則通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，合成或激活某些細(xì)胞因子來產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)作用。后面兩種機(jī)制的研究受到體外實(shí)驗(yàn)的限制。近年來逐漸開展起來的血清藥理學(xué)方法對中藥的藥理作用的研究，已形成熱點(diǎn)。給抗腫瘤中草藥的研究和開發(fā)，帶來了廣闊的前景。(2)許多中草藥能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是目前的文獻(xiàn)中，有關(guān)其分子機(jī)制的研究報(bào)道很少。例如中藥的有效成分是從哪個(gè)環(huán)節(jié)開始啟動腫瘤細(xì)胞的程序性死亡(凋亡的)，與何受體有關(guān)，是否需要載體的參與，能否在受體水平或受體傳遞環(huán)節(jié)上干擾細(xì)胞凋亡過程或細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過程等，都有待深入研究。(3)細(xì)胞凋亡是一種主動的受基因凋控的細(xì)胞自殺過程，許多基因如p53,Cmyc,bcl2及其相關(guān)基因bclx,bax,bad等均參與凋亡的調(diào)控。用中草藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是否也有凋亡相關(guān)基因的參與，對凋亡相關(guān)基因的影響如何，亦有待進(jìn)一步研究。(4)近年來對單味中草藥的抗癌成分研究較多，與西醫(yī)化療藥的研究有雷同之處。而臨床上治療腫瘤比較有效的多為方劑，是根據(jù)扶正、固本、驅(qū)邪的中醫(yī)理論制定的多味中藥復(fù)方。深入研究中藥方劑中各種成分的抗腫瘤機(jī)制，有助于進(jìn)一步發(fā)揮祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)在腫瘤防治領(lǐng)域的強(qiáng)大作用。(5)中藥在腫瘤的放、化療過程中能減輕其毒副作用，增加患者對放、化療的耐受性。是否可以通過中藥處理，提高腫瘤細(xì)胞對放、化療產(chǎn)生的凋亡誘導(dǎo)作用的敏感性，從而提高療效或在相同的療效下減輕放、化療的劑量，有著現(xiàn)實(shí)的研究意義。(6)目前中草藥對肝癌或白血病的體外培養(yǎng)細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用研究較多，而對于口腔腫瘤細(xì)胞模型的凋亡誘導(dǎo)作用罕見報(bào)道，且臨床上已經(jīng)證實(shí)抗口腔腫瘤有效的中藥方劑或單藥還是比較多的，有必要在此領(lǐng)域開展深入的研究。

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