豬血中超氧化物歧化酶SOD的分離純化及活力測(cè)定、同工酶電泳

原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一種能專一地清除超氧離子自由基（°）的金屬酶，它具有抗衰老、抗輻射、抗炎及抗癌等作用因而在醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)等方面有了廣泛的應(yīng)用前景。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途SOD是一種酸性蛋白，對(duì)熱、pH和蛋白酶的水解較一般酶穩(wěn)定。按照它所含金屬離子的不同，可分為Cu-Zn-SOD（二聚體，藍(lán)綠色）、Mn-SOD（紫紅色）和Fe-SOD（黃褐色）三種。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途SOD催化下述反應(yīng)1+2°2一比。2^2。機(jī)體內(nèi)的過量和不足均對(duì)機(jī)體不利,SOD對(duì)過量的°?的及時(shí)清除保證了機(jī)體內(nèi)。丄的含量相對(duì)的平衡。機(jī)體內(nèi)的°?形成可分為生理性和病理性兩方面。在一些正常生理過程中會(huì)形成一些例如：呼吸鏈中電子傳遞結(jié)果可產(chǎn)生一些。在某些疾?。ㄈ鐨逯卸?、輻射病等）過程中會(huì)產(chǎn)生大量的°2。過量的。2如不及時(shí)清除，會(huì)對(duì)細(xì)胞損傷。SOD將2歧化為比①和①，而過氧化氫（物）酶、谷胱甘肽過氧化酶可催化或氧化氫分解，在機(jī)體內(nèi)形成一套解毒系統(tǒng)，對(duì)機(jī)體起防護(hù)作用。個(gè)人收集整理有機(jī)溶劑沉淀法分離純化蛋白質(zhì)本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑沉淀法以新鮮豬血為原料，從中提取SOD并進(jìn)行分離純化。有機(jī)溶劑沉淀法的基本原理：①親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。常見的有機(jī)溶劑有丙酮和乙醇等。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途鄰苯三酚自氧化法測(cè)定酶活力酶活性測(cè)定的方法有以下幾種方法：鄰苯三酚自氧化法、黃嘌吟氧化酶法、NBT光還原法、化學(xué)發(fā)光法、腎上腺素自氧化法及亞硝酸法等。本實(shí)驗(yàn)SOD酶活性采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定，酶活性單位定義為：每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶單位。鄰苯三酚自氧化法的原理：利用鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，產(chǎn)生°》，生成有顏色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后先變成黃綠色，幾分鐘后轉(zhuǎn)為黃色，吸光度值與反應(yīng)時(shí)間能在3?4min內(nèi)維持線性關(guān)系。加入酶液則抑制自氧化的速率，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值即可。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途蛋白質(zhì)含量測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)G-250（CoomassicbrilliantblueG-250）在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈現(xiàn)藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)，溶液在595nm波長(zhǎng)下的光密度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測(cè)定，測(cè)定范圍在1?1000Pg。個(gè)人收集5.SOD同工酶分離鑒定SOD同工酶鑒定采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離鑒定。用“負(fù)”顯色法，核黃素（FAD）經(jīng)光照所產(chǎn)生的5（氧自由基）能使氯化硝基四氮藍(lán)（NBT）有黃色的氧化型轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的還原型。由于SOD能夠抑制。2的作用，因此，電泳分離SOD后，凝膠上無SOD出應(yīng)顯示為藍(lán)色，而有SOD處則無色透明，由此可鑒定SOD同工酶的酶譜（即同工酶的種類數(shù)量、分子量大小分布及活性大?。?。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途二、 操作步驟SOD的提取取新鮮豬血20ml于50ml離心管，6000r/min,lOmin離心，去上層血漿，取下層紅血球粘稠液，然后加入2倍體積的0.9%NaCl溶液清洗，6000r/min，lOmin離心，棄上層清液，再加入2倍體積的0.9%NaCl溶液重復(fù)清洗一次，6000r/min，10min離心，得洗凈的紅血球粘稠液。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途向洗凈的紅血球中加入等體積的蒸餾水，劇烈攪拌30min,使其充分溶血。再向溶血液中緩慢加入預(yù)冷的0.25倍體積的95%乙醇溶液和0.15倍體積的氯仿，勻漿呈暗紅色，再繼續(xù)攪拌15min，4000r/min,10min離心，去變性蛋白沉淀物，得上層液，留樣500ul（樣1）。然后將清液在65-70恒溫水浴中進(jìn)行熱處理,15min后取出迅速冷卻到室溫,4000r/min,5min離心除去沉淀，得淺黃色粗酶液，留樣500ul（樣2）。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途向粗酶液中加入等體積的丙酮溶液，冰箱靜置過夜，6000r/min，10min棄上清液，得沉淀。將沉淀物用等體積預(yù)冷的丙酮溶液清洗兩次，離心收集沉淀，自然干燥即得淡綠色成品，溶于3ml蒸餾水，備用（樣3）。SOD活力測(cè)定鄰苯三酚自氧化率的測(cè)定取4.5ml50mmol/LpH8.3的磷酸緩沖液，4.2ml蒸餾水和1ml10mmol/LEDTA-Na2溶液，混勻后在25°C水浴保溫20min，取出后立即加入25°C預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.3ml,迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，用10mmol/LHCl作空白，325nm波長(zhǎng)下每隔30s記錄光吸收值一次，整個(gè)操作在4min內(nèi)完成，計(jì)算出每分鐘A325的增值，此即為鄰苯三酚自氧化率。要求自氧化速率引起的吸光值變化控制在0.070/min左右。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用酶活力測(cè)定樣1、樣2及樣3中SOD酶活力測(cè)定操作與[1]基本一致，加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的SOD樣液，蒸餾水則減少相應(yīng)的體積，同理測(cè)其光吸收值，計(jì)算加酶后鄰苯三酚自氧化率。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途酶活性單位計(jì)算根據(jù)酶活性單位的定義，按下列公式計(jì)算酶活性：

總活性（U）=單位活性x酶原液總體積[4]蛋白質(zhì)含量測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)G-250法）：⑴標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支具塞試管，編號(hào)，按下表加入試劑試劑試管編號(hào)123456蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.0蒸餾水（ml）1.00.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250（ml）55555蛋白質(zhì)含量（Mg）020406080100蓋上塞子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。放置10分鐘，在595nm波長(zhǎng)下比色單位活性（U/ml）=單位活性（U/ml）=(A°?Am)/A0X100%50%樣液稀釋倍數(shù)x反應(yīng)液總體積數(shù)x卡液體杪'其中，.為鄰苯三酚自氧化率;八⑴加酶后鄰苯三酚自氧化率。測(cè)定光吸收值，比色應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成。以牛血清白蛋白含量（ug）為橫座標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途⑵樣品中蛋白含量的測(cè)定將待測(cè)的SOD溶解并稀釋到一定濃度，取3支試管，分別加入50M、100卩1、100M的樣1、樣2和樣3,再分別加入950卩1、900*1和900卩gl蒸餾水，3支試管中都加入5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途⑶蛋白質(zhì)含量計(jì)算根據(jù)所測(cè)樣品提取液的光吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（呃），計(jì)算其濃度。[5]結(jié)果處理利用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定每毫升酶原液蛋白質(zhì)毫克數(shù)。單位活力（U/ml） 總活力（U）[比活力<U/mg>二 「一 =蛋口h；⑴補(bǔ)將測(cè)得的數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果填入下表：提純步驟酶液總蛋白質(zhì)酶活性總活性比活性回收率純化倍體積mlmg/mlU/mlUU/mg(%)數(shù)除血蛋白上清熱變性后上清丙酮沉淀后的3.SOD同工酶鑒定（聚丙烯酰胺凝膠法）樣品制備取一定濃度（約SOD0.5mg/m1）酶液，酶液與40%蔗糖按1：1的體積比例配成樣品液，備用。制備凝膠（1） 用蒸餾水清洗兩塊玻璃板，兩條玻璃間隔條和一把梳子，涼干備用。（2） 組裝玻璃板。平放大玻璃板，蓋上有凹槽的小玻璃，用4個(gè)蝴蝶夾左右兩邊夾住玻璃的兩條邊固定這個(gè)組裝系統(tǒng)，左右兩邊封到3?4cm高即可。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途(3)配膠。取兩只潔凈的小燒杯、標(biāo)號(hào)，按下述試劑配方：試劑分離膠濃縮膠30%Acr-Bis(ml)2.00.4Tris-HCLPH8.9緩沖液(ml)1.5—Tris-HCLPH6.7緩沖液(ml)—0.5H2O(ml)4.51.510%AP(ml)0.150.075(4)灌膠。混合好膠液，應(yīng)馬上進(jìn)行灌膠。左手扶住組裝好的玻璃板，45度傾斜，凹形的小玻璃板朝上，右手將燒杯中膠液從凹口夾逢中均速灌入，待滿至離玻板口4cm左右停止灌分離膠。加蒸餾水水壓線，當(dāng)界面開始出現(xiàn)明顯的分隔線的時(shí)候，將水傾倒出，用濾紙吸干水分(注意不要損壞膠面)。將配好的濃縮膠按照同樣的方法勻速均勻倒入，滿至從頂部溢出，水平插入梳子，梳子的深度約lcm為好，過深，取梳子時(shí)容易損壞膠孔；過淺，上樣量受限制。注意：灌膠和插梳子時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。氣泡將嚴(yán)重影響凝膠的質(zhì)量，繼而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途靜置凝膠30min完成聚合反應(yīng)。清理玻璃凝膠板。小心取出梳子，去掉透明膠和4個(gè)蝴蝶夾，清洗玻璃板周邊的碎膠，

最后蒸餾水沖洗一遍后吸水紙擦干。此步操作應(yīng)避免擠壓玻璃板使膠變形。個(gè)人收集整理勿做上樣把清理好的玻璃凝膠板插入雙垂直電泳槽，大玻璃面朝外，凹形的小玻璃朝里，分

別用4個(gè)蝴蝶夾將玻璃凝膠板固定在電泳槽上。第二張膠板的裝法與第一張一致。如電泳槽

只跑一張膠，則只需把大玻璃固定在另一邊，形成裝緩沖溶液的上槽即可。個(gè)人收集整理勿做在電泳槽的上、下槽中加入電泳緩沖液，上槽的緩沖液加至淹沒凝膠1.5cm，下槽

加至沒過底邊玻璃1.5cm，觀察上槽是否漏液，如果漏液，必須重新組裝。個(gè)人收集整理勿電泳當(dāng)指示劑溴酚蘭離下邊緣還有l(wèi)cm的時(shí)候停止電泳，下膠染色。取出膠板顯帶用硬質(zhì)卡片揭去一塊玻璃板，另一塊板上的凝膠面傾斜，沿著凝膠一角注水，將膠版沖入培養(yǎng)皿，充分展開。倒入NBT溶液，嚴(yán)格避光浸泡20min，再放在2.8m1/L的EDTA-Na2溶液中，放置在日光下照射，至藍(lán)色背景下出現(xiàn)多條透明酶帶為止，觀察結(jié)果，拍照繪制模式圖。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途三、 結(jié)果1.SOD活力測(cè)定將含有SOD的樣1、樣2及樣3加入鄰苯三酚自氧化過程的反應(yīng)液中，記錄加樣體積

及每30s觀察的吸光度值，與鄰苯三酚自氧化率測(cè)定過程吸光度值同記錄與下表：個(gè)人收集吸光度值A(chǔ)325計(jì)時(shí)鄰苯三酚自氧化加SOD后的鄰苯三酚自氧化計(jì)時(shí)鄰苯三酚自氧化樣1a 樣2b 樣3c

00:00:000.0120.024-0.0390.03400:00:300.0450.031-0.0340.05100:01:000.0830.040-0.0280.06800:01:300.1240.050-0.0220.08500:02:000.1630.058-0.0170.10100:02:300.2010.067-0.0120.11600:03:000.2370.076-0.0070.13200:03:300.2700.084-0.0010.14700:04:000.3020.0930.0000.161a樣1為除去變性蛋白沉淀物后的上清液，加樣體積為50'1；b樣2為熱處理后除去沉淀物得到的上清酶液，加樣體積為100卩1；c樣3為加丙酮后沉淀物溶于蒸餾水而得的溶液，加樣體積為100卩1。根據(jù)公式：(力。?碼)/力0X100% 樣液稀釋倍數(shù)單位活性(U/ml)= "°% x反應(yīng)液總體積數(shù)x和:液體枳鄰苯三酚自氧化率A0=(0.302-0.012)/4min=0.07250min-1加入樣1、樣2和樣3后鄰苯三酚自氧化率A分別為：mA1=(0.093-0.024)/4min=0..01725min-1A2=(0.000+0.039)/4min=0.00975min-1A3=(0.161-0.034)/4min=0.03175min-1反應(yīng)液總體積都為10ml,即反應(yīng)液總體積數(shù)均為10；樣1、樣2和樣3均未稀釋，即樣液稀釋倍數(shù)都為1。因此，樣1、樣2和樣3中SOD單位活性分別為：個(gè)人收集整理勿做商(0.07250min'1-0..01725min"1)/0.07250min*1x100%b1=bb1=b2=b3=304.873U/mlx10xl°°川x10x10°Ml(0.07250min'1-0.00975min'1)/0.07250minx10xl°°川x10x10°Ml50%173.103U/ml(0.07250min'1-0.03175min'1)/0.07250min'1x100%50%一112.414U/m1個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途樣1、樣2和樣3的酶液總體積分別為V1=10.0ml、V2=9.5ml和V3=8.5ml,故其酶總活性分別為：個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途ci=b1V1=304.873U/mlX10.0ml=3048.276Uc=bV==173.103U/mlX9.5ml=1644.483U222

c3=b3V3=112.414U/mlX8.5ml=955.517U以除去變性蛋白沉淀物后的上清液（即樣1）中活性SOD的回收率為k1=100%，按酶總活性的大小計(jì)算各過程中SOD的回收率，則樣2和樣3的回收率分別為：個(gè)人收集整理勿k2=c2/c1=1644.483U/3048.276U=53.95%k3=c3/c1=955.517U/3048.276U=31.35%2.蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量與吸光度值a595的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定值如下表：蛋白質(zhì)含量（Pg）020406080100吸光度值a5950.0000.2940.3140.4020.540.672去掉偏差較大的點(diǎn)（0.294,20"g）后標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合如下圖:樣1、樣2和樣3的加樣量及吸光度值記錄于下表：樣品號(hào)加樣量川1樣品號(hào)加樣量川1吸光度值A(chǔ)樹重復(fù)I 重復(fù)II樣1250.3040.341樣21000.1500.145樣31000.0480.054因此，樣1、樣2和樣3中蛋白質(zhì)含量分別為：(0.304+0.341)/2x146.5840pgdi=25川=1.8903mg/mld2=(0.150+0.145)/2x146.5840pg=0.2162叫八"di=25川=1.8903mg/mld2=(0.150+0.145)/2x146.5840pg=0.2162叫八"100pl(0.048+0.054)/2X146.5840|ig=0.0748咋胡100^1d3=所以，樣1、樣2和樣3的比活力分別為304.873U/mle1=b/d,」用9（用川⑺川匸161.2048U/mg173.103U/mle2=方2/〃2=°刀川罵川I=800.6213U/mg112.414U/mle3=方3/〃3=°°7仙叫:川丨=1503.7058U/mg以除去變性蛋白沉淀物后的上清液（即樣1）得到的SOD純化倍數(shù)為n1=1，以各樣的比活力計(jì)算純化倍數(shù)，樣2和樣3的純化倍數(shù)分別為：個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途n2=e2/e1=800.6213U?mg-i/161.2048U?mg-1=4.96n3=e3/e1=1503.7058U?mg-1/161.2048U?mg-1=9.32酶活力測(cè)定的結(jié)果匯總于下表：提純步驟酶液總體積ml蛋白質(zhì)mg/ml酶活性U/ml總活性U比活性U/mg回收率（%）純化倍數(shù)除血蛋白上清101.8903304.8733048.276161.20481001熱變性后上清9.50.2162173.1031644.483800.621353.954.96丙酮沉淀后的8.50.0748112.414955.5171503.70631.359.32°2（氧自由基）清除，使得凝膠呈無色透明。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途四、 分析超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于真核細(xì)胞核和原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中，可清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基，有效抵抗氧自由基對(duì)機(jī)體的傷害［1］。通過對(duì)SOD的提取、分離和純化，發(fā)現(xiàn)豬血中含有豐富的SOD，且SOD的活性較高。此外，通過對(duì)提取樣液的聚丙烯酰胺凝膠，可以看出豬血中還含有SOD的同工酶。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途本實(shí)驗(yàn)中分離純化的SOD在丙酮沉淀后的比活力為1503.7058U/mg，與李敏康［2］等研究顯示的豬血SOD比活力較為一致。但前人對(duì)豬血中SOD活力研究表明，在60°C下處理15min，SOD活力最大，比活力可達(dá)4000U/mg以上［3-4］，更有研究表明豬血中SOD比活力可以達(dá)到6OOOU/mg以上［5-6］，影響豬血中SOD活性的因素很多，從豬血中提取SOD的過程中，若要分離出純度很高的SOD，熱變性時(shí)的溫度是至關(guān)重要的因素［378］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示豬血中SOD回收率僅為31.35%，純化倍數(shù)僅有9.32。而前人在丙酮沉淀后SOD的回收率可以達(dá)到近60%甚至更高［4,6］,晏本菊⑷等從豬血中制備SOD時(shí)純化倍數(shù)達(dá)26.00。個(gè)人SOD同工酶電泳結(jié)果表明，豬血中含有SOD的同工酶，且活性較高，但是種類數(shù)量很少。對(duì)于SOD的同工酶，在水生生物(魚類等)和植物中研究較多［9-12］，而關(guān)于豬血中SOD同工酶鮮見報(bào)道。對(duì)其他動(dòng)物和植物的研究顯示，SOD的同工酶種類較多，分子量分布也較為廣泛［9-12］。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途本實(shí)驗(yàn)中提取的豬血中的SOD的比活力相對(duì)較低，回收率和純化倍數(shù)也非常低，鑒定出的SOD同工酶數(shù)量極少，可能的原因有供試用豬血新鮮程度不夠，導(dǎo)致其中SOD已有部分失活，而提取設(shè)備和條件的不足也是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠理想的重要原因，此外，操作人員對(duì)提取過程的熟練程度也是影響結(jié)果的因素之一。個(gè)人收集整理勿做商業(yè)用途參考文獻(xiàn)［1］ 陳鴻鵬，譚曉鳳?超