堿裂解法提取質粒

堿裂解法提取質粒第1頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

通過質粒的一些特性、質粒DNA的提取、測定，學習用堿變性法提取質粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質粒DNA的原理及操作。一、實驗目的第2頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒(Plasmid)：質粒是細菌細胞內一種自我復制的環(huán)狀雙鏈DNA分子，能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。在細胞內它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。二、實驗原理第3頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月第4頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點：

易于鑒定；在受體細胞中可以獨立復制；易于篩選；易于導入受體細胞。

第5頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月二、實驗原理高堿細菌的細胞壁破裂，內容物釋放①染色體DNA斷裂成不同長度的線性雙鏈DNA；②線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。①質粒DNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；②雙鏈DNA并不完全分離。高酸中和至中性變性的染色體DNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網絡狀大分子不溶性沉淀物質粒DNA又恢復天然構型，溶解在上清液中純化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質第6頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性(NaOH)環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質粒DNA將迅速復性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質粒DNA從細菌中提取出來。第7頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月三、主要試劑及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成(保護、緩沖)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質粒(保護作用)EDTA

的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子,防止DNA酶對質粒分子的降解作用（保護作用）Tris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）8第8頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成(裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性（裂解細胞和蛋白質變性作用）NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）9第9頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月溶液III：HAc和KAc組成的高鹽溶液(復性，分離)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA變性而發(fā)生纏繞，并使質粒DNA復性。KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成沉淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質-SDS復合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。第10頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月四、試劑配制

溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)。

1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS。2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3.溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆?。?1頁，課件共12頁，創(chuàng)作于2023年2月4.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7.5×TBE：Tris堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。15lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?.R