冰凍切片機破碎大鼠心肌組織提取rna的方法

冰凍切片機破碎大鼠心肌組織提取rna的方法

獲得高質(zhì)量的自然資源是研究生物材料的必要條件和關(guān)鍵技術(shù)。1材料和方法1.1合成構(gòu)建聚合物L(fēng)eicaCM1900冰凍切片機(德國Leica公司),市售合成膠水,ND-1000微量紫外可見分光光度計(美國NanoDrop公司),全自動凝膠成像系統(tǒng)GelDocXR1.2nase消除所用研缽、剪刀、鑷子、離心管(Ep管)、槍頭等器具,均經(jīng)0.1%DEPCH1.3gaaggaacrtgac-3,apos的結(jié)構(gòu)根據(jù)GenBank上公布的β-actin基因序列設(shè)計引物:P1:5'-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3',P2:5'-CTGGAAGGTGGACAGTGAG-3';所擴增的目的片段長度約為445bp,引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。1.4中心提供服務(wù)雄性SD大鼠,體重350~370g,由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。操作人員戴上口罩和手套,麻醉大鼠,取出心臟,立即用剪刀剪成3mm×3mm×3mm左右的小組織塊,每粒組織放入一個做好標記的0.2ml的EP管內(nèi),立即置入液氮中保存。1.5液氮研究進展將樣本分成兩組,即液氮研磨法組和冰凍切片法組,分別提取RNA。(1)液氮研磨法:抽提前先在碾缽中加入適量的液氮,再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。碾磨過程中要及時補充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨成粉末狀后,等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時,立即加入1mlTRNzol裂解液繼續(xù)快速勻漿。然后按照RNA(小量)抽提試劑盒說明書方法提取RNA。使用液氮碾磨要特別注意一點:在整個碾磨過程中,樣品不得融化,因為解凍后內(nèi)源RNase更容易起作用破壞RNA;(2)冰凍切片法:將液氮中保存的裝有大鼠心肌組織的EP管取出后立即快速放入冰凍切片機箱體中。在樣本頭上滴加適量的合成膠水,將樣本粘在樣本頭上,以4μm的厚度連續(xù)切片切完樣品,注意不要切到膠水部分。用槍頭將切出來的組織碎片,快速轉(zhuǎn)移到預(yù)先加了1mlTRNzol裂解液的1.5ml的Ep管中,充分混勻。然后按照RNA(小量)抽提試劑盒說明書方法提取RNA。1.6任濃度、純度和完整性試驗取1μl提取的RNA,用微量紫外分光光度法測定其濃度、OD1.7—β-actin基因的RT-PCR擴增按FirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行逆轉(zhuǎn)錄(RT),引物為Oligo(dT)2結(jié)果2.1對羥基溫度和濃度的紫外掃描紫外分光光度法測得RNA濃度液氮研磨法組為2.59μg/μl,冰凍切片法組為2.05μg/μl。紫外吸收OD2.2凍切片法提取rna的兩組典型條帶瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,液氮研磨法和冰凍切片法提取的RNA,可見兩條明顯的條帶(圖1)。28srRNA與18srRNA條帶亮度之比大于1,說明RNA未被降解。2.3—β-actin基因的PCR擴增結(jié)果分析反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖電泳分析,在約445bp處有明亮條帶顯示(圖2),與預(yù)計長度一致。3冰激凌切片機切片提取高質(zhì)量的RNA是進行基因克隆、基因表達等分子生物學(xué)研究的前提。樣品離開活體或者原來的生長環(huán)境后,樣品中的內(nèi)源RNase即會開始降解RNA,降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度呈正相關(guān)。組織RNA提取時,在研磨破碎組織操作中,關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是使組織細胞盡快與裂解液充分接觸,從而抑制RNase活性。但由于組織塊有一定的厚度,裂解液不能快速滲入,導(dǎo)致內(nèi)源性RNase降解RNA增加,使提取的RNA質(zhì)量下降。因此,如果能在研磨破碎組織操作中抑制RNA酶活性,降解問題也就可以解決了。液氮碾磨就是目前使用最多、最有效的一種辦法細胞的平均直徑為10~20μm,冰凍切片機切片厚度可以達到幾微米,完全能夠充分地將細胞切碎。本課題組在實驗工作中,發(fā)現(xiàn)用冰凍切片機來切冰凍組織時,如果采用較薄的厚度進行切片,完全能夠達到破碎組織細胞的目的。冰凍切片機切片過程中,環(huán)境溫度可以維持在大約-25℃~-30℃的較低水平,RNA酶活性也能被充分抑制。而且冰凍切片機切片迅速,如果操作人員動作熟練,可以在很短的時間內(nèi)完成操作,將切出來的組織快速溶解在裂解液中,再做后續(xù)提取RNA的實驗操作,能獲得高質(zhì)量RNA。通