安徽省克氏原螯蝦白斑綜合征的發(fā)生與防治

安徽省克氏原螯蝦白斑綜合征的發(fā)生與防治

皮膚病毒科（wssv）是線頭病毒科（nimavirius）的唯一成員，在臺灣和大陸沿海地區(qū)的早期流行于該市。WSSV的基因組大小約300kb,Marks等1材料和方法1.1材料表面1.1.1樣本采集和保存本實(shí)驗(yàn)于2016年4—8月在安徽省滁州、合肥、安慶、六安、池州和蕪湖市的8個(gè)克氏原螯蝦養(yǎng)殖場采集9個(gè)樣本,樣本4與5采自同一個(gè)養(yǎng)殖場的不同塘口,各樣本取蝦20~30只,體重約20g,所有樣本采集后均置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?個(gè)采樣點(diǎn)中有2個(gè)在養(yǎng)殖期間未出現(xiàn)爆發(fā)性死亡,其他采樣點(diǎn)均出現(xiàn)爆發(fā)性死亡,詳見表1。1.2方法1.2.1pcr擴(kuò)增條件取適量克氏原螯蝦鰓組織進(jìn)行研磨,用TIANampGenomicDNAKit(離心柱型DP304)提取DNA,采用WSSV國標(biāo)GB/T28630的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,套式PCR的引物及反應(yīng)條件見表2。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。1.2.2f65、orf鋼的基因組化和分布用鰓組織抽提的DNA擴(kuò)增WSSV可變區(qū)ORF75、ORF94和ORF125序列。PCR反應(yīng)體系:無菌蒸餾水33.5μL,10×PCR緩沖液5μL(含1.5mmol·L1.2.3dna純化回收WSSV可變區(qū)ORF75、ORF94和ORF125陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)TakaraMINIBESTagarosegelDNAextractionkit純化回收,與pMD18-T連接,然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a,接著涂布于含氨芐青霉素(100μg·mL2結(jié)果與分析2.1無線傳感器網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的測試結(jié)果采集的9個(gè)養(yǎng)殖克氏原螯蝦樣本均在第1輪WSSVPCR擴(kuò)增中獲得陽性結(jié)果。2.2基因型和基因型檢測bp池州樣本8可變區(qū)ORF94擴(kuò)增出2個(gè)擴(kuò)增子,其他樣本均產(chǎn)生單擴(kuò)增子(見圖1)。10個(gè)擴(kuò)增子中含5種不同大小的片段,大小為428~968bp,對應(yīng)的54bp重復(fù)單元(repeatunit,RU)基因型為5個(gè),RU數(shù)量為2、4、7、8和12,分別從5個(gè)(六安、滁州和安慶)、2個(gè)(蕪湖和合肥)、1個(gè)(合肥)、1個(gè)(池州)、1個(gè)(池州)樣本中檢出(表3)。這些擴(kuò)增子在RU第48位堿基上出現(xiàn)G或者T的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),但同一基因型的擴(kuò)增子序列完全一致。2.3擴(kuò)增子ros排列9個(gè)樣本ORF75擴(kuò)增均獲得1個(gè)擴(kuò)增子,結(jié)果見圖2。擴(kuò)增子的序列為717~1376bp,每個(gè)擴(kuò)增子均存在2種RUs,45bp和102bp,2種RUs總數(shù)為3、6、9、10和11(見表4)。9RUs來自5個(gè)樣本(合肥、六安和滁州),排列順序均為45、102、45、102、3×45、102和45,其他4個(gè)樣本擴(kuò)增子RUs數(shù)量及排列方式均不相同。除池州樣本8的擴(kuò)增子RUs排列以102和2×45開頭外,其他的RUs排列均以45、102和45開頭,第4個(gè)RU出現(xiàn)差異。獲得擴(kuò)增子在45bpRU的第3、15、30、40、42和44位點(diǎn)和102bpRU的第3、15、25、30和83位點(diǎn)存在SNPs。9RUs的5個(gè)擴(kuò)增子除102bpRU的25位點(diǎn)存在SNP變異外,其他序列一致。2.4pcr擴(kuò)增結(jié)果池州樣本8可變區(qū)ORF125擴(kuò)增出2個(gè)擴(kuò)增子,其他樣本均擴(kuò)增出1個(gè)擴(kuò)增子(見圖3)。擴(kuò)增子的序列為652~929bp,RUs為5~9,其中7RUs、6RUs分別從4個(gè)、3個(gè)樣本中擴(kuò)增(見表5)。擴(kuò)增子的開始RUs為72bp,比其他RUs多18~20位的GCA堿基。開始RUs具有獨(dú)特的SNPs,指定為A和B。樣本4和5的開始RUs排序?yàn)锳AB,樣本9的排序?yàn)锳AAB,其他樣本的排序均為AB。中間RUs有2~6個(gè),第18,66和69位核苷酸有SNPs,指定為C-F。結(jié)尾RUs也具有獨(dú)特的SNPs,指定為T,T的數(shù)量為0~3,不同擴(kuò)增子間T的序列完全一致。10個(gè)擴(kuò)增子中只有安慶的樣本4和5的RUs排列完全一致,滁州的樣本1和7的中間RUs第18位存在SNP。3wssvorf65感染克氏原螯蝦的基因型研究本研究從安徽省6個(gè)市采集的9個(gè)養(yǎng)殖克氏原螯蝦樣本W(wǎng)SSVPCR檢測結(jié)果均為陽性,從水庫和魚塘取樣的6個(gè)野生克氏原螯蝦樣本(合肥5個(gè),舒城1個(gè))PCR檢測結(jié)果均為陰性(數(shù)據(jù)未顯示),表明目前WSSV主要在安徽人工養(yǎng)殖的克氏原螯蝦中流行。本實(shí)驗(yàn)9個(gè)樣本W(wǎng)SSVORF94有5個(gè)基因型,RUs為2、4、7、8和12,其中2RUs存在于六安、滁州和安慶的5個(gè)樣本中,這是國內(nèi)外最小的常見基因型。海南、廣西、江蘇、浙江、河北、山東、遼寧、福建、廣州、天津和湖北WSSVORF94的RUs為3~14本實(shí)驗(yàn)中WSSVORF75擴(kuò)增子的RUs為3、6、9、10和11,其中9RUs來自合肥、六安、滁州的5個(gè)樣本,為常見基因型,在國內(nèi)外,該基因型只在山東膠南檢測到本實(shí)驗(yàn)WSSVORF125的RUs為5~9,7RUs從六安、合肥和蕪湖的4個(gè)樣本獲得,6RUs從滁州和池州的3個(gè)樣本獲得。這2種基因型,在國內(nèi)廣泛分布于江蘇、廣東、山東、天津和河北本研究中池州樣本8可變區(qū)ORF94和ORF125均擴(kuò)增出2個(gè)不同大小的擴(kuò)增子,揭示取樣池塘克氏原螯蝦體內(nèi)存在不同基因型病毒混合感染的情況。因樣本8的3個(gè)可變區(qū)產(chǎn)生的擴(kuò)增子數(shù)量不同,去掉該樣本數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)另8個(gè)樣本W(wǎng)SSV的ORF94只有3個(gè)基因型,ORF75和ORF125均有4個(gè)基因型。這與之前的報(bào)道不一致,ORF94一直被認(rèn)為是RU數(shù)量變化最多的基因,也因此被認(rèn)為是3個(gè)基因中最適合用于小地理范圍進(jìn)行WSSV基因組變異研究的基因本研究中9個(gè)樣本均在WSSV第1輪檢測中出現(xiàn)陽性,表明樣本中均存在大量病毒,但樣本2和7取樣點(diǎn)克氏原螯蝦未出現(xiàn)暴發(fā)性死亡,取