木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用

木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用

木聚糖是植物的重要成分。植物核心的含量低于想象的纖維含量，約為35%。這是一種高度異構(gòu)的混合糖，很難分解。自然界中的許多木聚糖沒有得到有效利用，導(dǎo)致資源浪費(fèi)。木聚糖酶是一類能夠特異降解木聚糖的酶類,主要是由β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶和β-1,4-D-外切木糖苷酶組成,此外還有一些脫支鏈酶。木聚糖酶能夠降解木聚糖生成聚合度為2～10的低聚木糖混合物,該產(chǎn)物具有很高的經(jīng)濟(jì)價值,因此近年來,木聚糖酶在造紙工業(yè)、食品、能源、飼料以及環(huán)境等領(lǐng)域均顯示了廣闊的應(yīng)用前景。木聚糖酶在去污洗滌,醫(yī)藥等行業(yè)中也有應(yīng)用。另據(jù)報道,木聚糖酶在果實成熟、種子萌發(fā)、真菌的寄生及植物的抗性等諸多生理過程中也有重要作用。1實驗材料1.1蘑菇好食脈孢霉(N.sitopHila),齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院生化工程實驗室保藏提供,斜面(PDA)培養(yǎng)基保存。1.2儀器、設(shè)備和儀器電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司),隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器廠),DL102電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市實驗儀器廠),壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備股份公司),光學(xué)顯微鏡(Olympus),血球計數(shù)板(國營上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠),UV-120-02紫外分光光度計(日本津島),酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司),HYG-Ⅲ回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜(上海新蕊自動化設(shè)備有限公司),電子萬用爐(天津市泰斯特儀器有限公司),微量移液器(荊花)。1.3培養(yǎng)基1.3.1斜培養(yǎng)基pda馬鈴薯200g去皮,切塊煮沸30min,然后用紗布過濾,再加葡萄糖20g及瓊脂20g,溶化后用水定容至1000mL,pH自然。1.3.2種子培養(yǎng)部位3%麩皮水(麩皮水制備:3g麩皮加水100mL,浸泡1h,煮沸1h,過濾取汁、定容)、1.5%蛋白胨、pH5.0。1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。2實驗方法2.1培訓(xùn)方法2.1.1面部生長取好食脈孢霉一支,打開后用接種環(huán)轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基中,28℃恒溫培養(yǎng)3d,放入冰箱中備用。2.1.2角瓶培養(yǎng)液的制備向保存的好食脈孢霉斜面中加入5～10mL無菌水,然后用接種針將培養(yǎng)基表面的菌落刮下,轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中,震蕩搖勻,制成孢子懸液,用顯微鏡計數(shù)后,再取適量的懸液接入裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,使其孢子數(shù)達(dá)到105個/mL,于28℃,150r/min下震蕩培養(yǎng)。2.1.3不同濃度三角瓶對酶活力的測定將液體種子接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,于一定的轉(zhuǎn)速和溫度的回轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng),每個做三個平行樣,并定時取樣測定酶活力。2.2粗酶液組將發(fā)酵液用濾紙真空抽濾后所得的清液,即為粗酶液。酶活力定義為:在45℃,pH4.4條件下,每分鐘分解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。2.3酶解-n-msds-3-甲基苯磺酸酯酶系統(tǒng)的制備木聚糖酶活力的測定常用方法有:Na3AsO4法、液相色譜法、DNS法,其中最常用的為DNS法,本文采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)法。底物為0.4%木聚糖溶液(pH4.4),取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中,加入1.5mL底物溶液,45℃水浴反應(yīng)30min,加入1.5mLDNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷卻至室溫,加蒸餾水定容至25mL,540nm測定吸光值?？瞻讓φ?取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液于比色管中,煮沸5min使酶失活,加入1.5mL底物溶液,45℃水浴反應(yīng)30min,加入1.5mLDNS溶液后在沸水浴中煮沸5min。迅速用冷水冷卻至室溫,加蒸餾水定容至25mL,540nm測定吸光值。液體木聚糖酶活力公式X(mg):反應(yīng)結(jié)束時酶水解底物產(chǎn)生的還原糖的毫克數(shù);Y(mL/g):酶的稀釋倍數(shù);150.13(mg/mmol):木糖的相對分子質(zhì)量;30(min):反應(yīng)時間(min);0.5(mL):加入酶液量;1000:將mmol轉(zhuǎn)化成μmol所乘的系數(shù)。3影響酶活性的因素3.1豆?jié){、濕豆渣、濕豆渣以及2.5%蛋白的發(fā)酵以3%麩皮水為碳源,分別以0.5%蛋白胨、6%濕豆渣、1.4%豆粕、0.5%蛋白胨和6%濕豆渣及0.5%蛋白胨和1.4%豆粕為氮源,發(fā)酵溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為150r/min,初始pH值自然進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),選擇接種量為3%,每組三個平行,發(fā)酵72h后測酶活。3.2接種量的確定發(fā)酵溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然條件下,分別選擇接種量為0.5%、1%、3%、5%、7%,每組三個平行,發(fā)酵72h后測酶活。3.3液體發(fā)酵時間分別選取發(fā)酵溫度20℃、25℃、28℃、32℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然進(jìn)行液體發(fā)酵,選擇接種量為3%,每組三個平行,發(fā)酵時間為72h,測定各溫度下的酶活力。4結(jié)果與討論4.1培養(yǎng)時間菌體干重在溫度為28℃,轉(zhuǎn)速150r/min、初始pH值為5.0的條件下培養(yǎng)48h,每4h取樣一次,烘干至恒重,測干重,各發(fā)酵時間的菌體干重如表4-1所示。4.2木聚糖酶活力比較培養(yǎng)基是提供微生物生長繁殖和生物各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。按表2配制發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,溫度為28℃,轉(zhuǎn)速為150r/min,初始pH值自然。進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵時間為72h。各發(fā)酵培養(yǎng)基的木聚糖酶活力,如表3。4號培養(yǎng)基木聚糖酶活力相對較高,但是總的來說酶活力低,無法用于實際生產(chǎn)中。從4號和5號培養(yǎng)基可以看出豆渣更適合為這個菌株提供氮源,所以決定由豆渣提供氮源,考慮加大培養(yǎng)基中氮源的量,即豆渣的含量,并且同時加入直接碳源葡萄糖,看直接碳源和氮源量的變化是否對菌株產(chǎn)木聚糖酶活力有影響。豆渣含量不同的培養(yǎng)基木聚糖酶活力如表5。如從表5所示結(jié)果,直接碳源葡萄糖對木聚糖酶活力沒有影響,并且不加蛋白胨只加豆渣的培養(yǎng)基產(chǎn)的木聚糖酶活力是無法達(dá)到加入蛋白胨的培養(yǎng)基產(chǎn)的木聚糖酶活力的。所以,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基為3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自然。4.3接種量的確定接種量是指種子培養(yǎng)液體積和發(fā)酵液體積之比。本實驗選取在溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然條件下,分別選擇接種量為0.5%、1%、3%、5%、7%進(jìn)行發(fā)酵實驗,在72h取樣測酶活。本實驗研究不同接種量對產(chǎn)酶的影響,木聚糖酶活力如表6。如表6所示,接種量以1%最佳,此時產(chǎn)生的木聚糖酶活力最高。接種量過低,所需要的培養(yǎng)周期長,木聚糖酶活力降低;接種量過高,雖然培養(yǎng)時間縮短,但木聚糖酶活力達(dá)不到最佳值。4.4發(fā)酵溫度對木聚糖酶活力的影響本實驗分別選取發(fā)酵溫度20℃、25℃、28℃、32℃、轉(zhuǎn)速為150r/min、初始pH值自然進(jìn)行液體發(fā)酵,發(fā)酵時間為72h。測定各溫度下的酶活力如表7。如表7所示,溫度對該菌木聚糖酶的產(chǎn)生有顯著影響。培養(yǎng)溫度為25～28℃時,有利于木聚糖酶的合成,此時木聚糖酶活力較高。低于25℃時溫度偏低,菌體生長較慢,產(chǎn)酶活力較低,所以選擇在28℃下發(fā)酵。5接種量與溫度對木聚糖酶產(chǎn)量的影響本實驗研究表明合理的碳氮比對好食脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶有很大的影響,合理的碳氮比有利于木聚糖酶的合成。實驗研究表明脈孢霉在3%麩皮水、1.5%蛋白胨、pH5.0的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng),搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min,發(fā)酵溫度為28℃條件下培養(yǎng)12～32h后的種子培養(yǎng)液適宜接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:3%麩皮水、0.5%蛋白胨、6%豆渣、pH自