蚯蚓激酶及其口服油包水wo型微乳制劑對大鼠肝纖維化的影響

蚯蚓激酶及其口服油包水wo型微乳制劑對大鼠肝纖維化的影響

中國是世界上受影響最大的肝臟疾病之一。慢性肝炎和肝硬化是許多和不可避免的。肝纖維化是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時,肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過程,輕者稱為肝纖維化,重者進而使肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉及結(jié)節(jié)形成,稱為肝硬化。這個由“肝炎→肝纖維化→肝硬化”組成的“三步曲”是各種慢性肝病導(dǎo)致嚴重后果的共同途徑。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,已明確提出肝纖維化完全有可能逆轉(zhuǎn)的論點。因此,肝纖維化的研究成為世界醫(yī)學(xué)的熱點課題。近年來,國內(nèi)外尤其是國內(nèi)已有多篇文章論述了中藥在抗肝纖維化的基礎(chǔ)和臨床方面有顯著的療效。地龍是我國傳統(tǒng)的中藥材,蚓激酶是其主要的活性成分,具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶,對纖維蛋白有特殊親合力,有利于血栓的防治,已廣泛用于腦梗塞的治療。本實驗將蚓激酶及其口服微乳制劑用于大鼠肝纖維化,觀察其預(yù)防肝纖維化形成的作用。1材料和方法1.1動物雄性SD大鼠46只,體重160±10g,購自河南省實驗動物中心(動物許可證號:SCXK(豫)2010-0002)。1.2藥物、試劑與儀器四氯化碳CCl4(上海四星醫(yī)藥科技工貿(mào)公司出品);精制花生油(山東魯花集團產(chǎn)品);蚓激酶(江中藥業(yè)股份有限公司);辛癸酸甘油三酯(LabrafacCC)、聚乙二醇辛癸酸甘油酯(Labrasol)、聚甘油-6-二油酸(PlurolOleiqueCC497)(上海三齊醫(yī)藥科技有限公司);1mL、2mL和50mL一次性注射器若干。1.3w/o型微乳體系的合成稱取一定量的蚓激酶溶解于生理氯化鈉溶液中,將油相(LABRAFACCC中鏈甘油三酯)、表面活性劑(LABRASOL辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯)、助表面活性劑(PLUROLOLEIQUECC497聚甘油脂肪酸酯)、以及蚓激酶生理氯化鈉溶液按重量比27∶9∶9∶5混合后輕輕攪拌,即得透明均一的W/O型微乳體系。1.4組m組,4.2試驗方法46只大鼠隨機分成5組:正常組(N組,6只),正常飲食,自來水;陰性對照組(NC組,10只),單蒸水灌胃,花生油皮下注射;模型組(M組,10只),單蒸水灌胃,皮下注射40%CCl4精制花生油溶液混合液,首劑為75%CCl4花生油混合液0.5mL/100g,以后0.2mL/100g,每周2次,共8周;蚓激酶組(Y組,10只),蚓激酶單蒸水溶液灌胃,蚓激酶用量25mg/(kg·d),造模方法同M組;蚓激酶微乳組(YR組,10只),蚓激酶微乳灌胃,蚓激酶用量25mg/(kg·d),造模方法同M組。所有藥物均現(xiàn)配現(xiàn)用,每只大鼠用藥前均稱體重。1.5心功能檢測組存活大鼠均于第八周末處死,取全血,室溫下靜置4h,4℃離心,4000轉(zhuǎn),15min,每份標本取血清2mL置于4℃冰箱內(nèi),作肝功能指標檢測。取同一部位切除的肝臟于10%中性緩沖福爾馬林液中固定,石蠟包埋,切片。1.6肝纖維化分級①肝組織切片纖維化程度分級:大鼠肝組織經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液中固定、取材、酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片,厚度為4μm,作HE染色(蘇木素-伊紅染色)肝纖維化程度分級。肝組織切片行蘇木精-伊紅染色,將肝纖維化分為一～++++級:“一”為無成纖維細胞增生,“+”為小葉內(nèi)細纖維間隔偶見,匯管區(qū)擴大無隔;“++”為小葉內(nèi)細纖維間隔易見,匯管區(qū)擴大有隔;“+++”假小葉形成,隔致密較寬,小于半個高倍視野;“++++”假小葉明顯,纖維隔較寬,大于半個高倍視野。②血清ALT、AST及AST/ALT檢測:以含20μL肝素試管采集全血,離心獲取血清,用ALT和AST試劑盒說明書測定血清ALT和AST活性,計算AST/ALT值。1.7統(tǒng)計處理計量資料以xˉ±sxˉ±s表示,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析,等級計數(shù)資料用秩和檢驗,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。2結(jié)果2.1鼠精神狀況N及NC組大鼠發(fā)育良好,活潑好動。M組大鼠精神差,活動少,發(fā)育遲緩,皮毛松馳,毛黯淡,消瘦。Y及YR組動物健康狀態(tài)相對較好,皮毛柔順有光澤,灌胃時較兇猛。2.2肝組織病理學(xué)觀察造模結(jié)束時,與N和NC組相比,M組肝組織表面光亮度下降,顏色灰暗,邊緣不規(guī)則、質(zhì)脆,肝表面可見粗細不等的結(jié)節(jié)。Y、YR組肝組織紅潤,呈花斑狀,柔軟,未見明顯結(jié)節(jié)。2.3y、yr組不同時間點巖細胞增殖情況HE染色顯示M組主要為肝細胞壞死、小葉結(jié)構(gòu)破壞、炎性細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生、纖維分隔包繞和假小葉形成,Y、YR組以肝細胞變性為主,肝細胞壞死、炎性細胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生較M組明顯減輕(P<0.05),且YR組優(yōu)于Y組(P<0.05)(見表1)。2.4血清ast/alt的比值對判斷肝纖維化和插裝置加工的影響血清AST和ALT被認為是肝細胞損傷最敏感指標,但其升高幅度與肝病嚴重程度不一定平行。血清AST/ALT的比值對肝纖維化和肝硬化等病理改變,有助于判斷肝細胞病變的程度。比值越高,說明肝細胞損害越嚴重。Y、YR組與M組相比血清AST/ALT的比值明顯降低(P<0.05),且YR組優(yōu)于Y組(P<0.05)(見表2)。3纖溶酶原-纖維組織及抑制劑的作用本實驗結(jié)果顯示,與模型組相比,蚓激酶組及蚓激酶微乳組一般情況較好,肝纖維化程度明顯減輕,血清AST/ALT的比值明顯降低。說明蚓激酶對實驗性大鼠肝纖維化模型有抑制作用。同時,我們發(fā)現(xiàn)蚓激酶制備成W/O型微乳后,能明顯提高療效。目前認為,肝纖維化是多種致病因子使肝星狀細胞(HSC)激活后,纖維生成與降解失去平衡所致,纖維生成超過了纖維降解,細胞外基質(zhì)(ECM)便過度地在肝臟沉積。有研究表明在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展各個階段中纖溶酶原-纖溶酶系統(tǒng)發(fā)揮了重要的作用。纖溶酶是主要的蛋白分解酶,纖溶酶既可以直接降解ECM,也可以激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs),參與ECM的降解。蚓激酶是具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶,關(guān)于蚓激酶抑制肝內(nèi)纖維組織的形成及其相關(guān)機制尚需進一步研究。前期研究表明,蚓激酶在pH