抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)?zāi)芰Φ脑u(píng)估

抗結(jié)核藥物敏感性試驗(yàn)?zāi)芰Φ脑u(píng)估

實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制已成為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理中不可或缺的一部分，在保證實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證、能力改進(jìn)、檢驗(yàn)工作效率和可靠性方面發(fā)揮著非常重要的作用。由于當(dāng)前耐藥結(jié)核病的防治已成為一大難題,耐藥結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)、診斷與治療需以抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱藥敏)為依據(jù),而抗結(jié)核藥敏試驗(yàn)所提供的檢測(cè)結(jié)果是否正確至關(guān)重要。為提高和保證藥敏試驗(yàn)質(zhì)量和結(jié)果的可靠性。我室參加了中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比室在全國(guó)省級(jí)疾病預(yù)防控制中心組織實(shí)施的抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)工作,通過(guò)比對(duì),驗(yàn)證藥敏試驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù),現(xiàn)將我室2008—2010年間分別參加的3次測(cè)試結(jié)果分析如下。1材料和方法1.1試驗(yàn)消毒每次測(cè)試,國(guó)家參比室均下發(fā)30株盲樣菌株,由不同的耐藥株和敏感株構(gòu)成。1.2菌種的活化培養(yǎng)按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》,我們收到盲樣菌株管后,將下發(fā)的含菌2mL羅氏培養(yǎng)基凍存管置37℃恒溫箱孵育24h后,轉(zhuǎn)種至改良羅氏培養(yǎng)基中,37℃生長(zhǎng)2周,挑取肉眼可見菌落,磨制成菌懸液。1.3檢測(cè)藥物敏感的方法采用世界衛(wèi)生組織推薦使用的比例法。1.3.1儀器與設(shè)備ThermoⅡ級(jí)生物安全柜,SartoriusBSA型分析天平,ZHN-4型蒸氣恒溫箱,上海躍進(jìn)隔水式恒溫培養(yǎng)箱,渦旋振蕩器,天津合普接種環(huán)加熱滅菌器。1.3.2試劑和材料二甲基甲酰胺試劑,10%吐溫-80,麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管,生理鹽水,試管、磨菌管,藥敏培養(yǎng)基,22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)。1.3.3煙、鏈霉素、乙胺丁醇、emb配制培養(yǎng)基,4種一線藥物培養(yǎng)基內(nèi)終濃度為:利福平(RFP,40μg/mL)、異煙肼(INH,0.2μg/mL)、鏈霉素(SM,4μg/mL)、乙胺丁醇(EMB,2μg/mL)。每批次含藥培養(yǎng)基的制作,均根據(jù)國(guó)家參比室下發(fā)的藥粉效價(jià)具體計(jì)算含藥量。收到藥粉后,除將RFP進(jìn)行冷凍保存外,其他3種藥物進(jìn)行冷藏保存。1.3.4菌株的準(zhǔn)備和接種(1)挑取培養(yǎng)物:灼燒并冷卻接種環(huán),在培養(yǎng)基表面的各個(gè)部位挑取適量菌落,放入加有吐溫-80溶液的磨菌管,將磨菌棒插入磨菌管,旋轉(zhuǎn)磨菌棒進(jìn)行磨菌,磨至呈乳酪樣。(2)配置1mg/mL菌懸液:磨完菌,向磨菌管內(nèi)加入少許滅菌生理鹽水混勻,待菌液靜置后,用滴管將菌液吸到10mL大試管中,加入滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,將該菌液與1mg/mL麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管進(jìn)行比濁,肉眼觀察,直至渾濁度基本一致,即為1mg/mL菌懸液。(3)配置10-2mg/mL和10-4mg/mL菌液:每株菌株準(zhǔn)備2支5mL試管,每管先加入2mL生理鹽水,用接種環(huán)挑取1環(huán)1mg/mL菌懸液加入至其中一支試管混勻得到10-2mg/mL菌液,再用接種環(huán)挑取2環(huán)10-2mg/mL菌懸液加入至另一支試管中混勻得到10-4mg/mL菌液。(4)接種:用接種環(huán)分別挑取10-2mg/mL和10-4mg/mL菌液,分別接種于按編號(hào)對(duì)應(yīng)準(zhǔn)備好的藥敏培養(yǎng)基斜面上。接種完畢后,將藥敏培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng),4周觀察結(jié)果。1.4受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)除以對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù),若耐藥百分比大于或等于1%,則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。每批試驗(yàn)結(jié)束后,將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)國(guó)家參比室,由國(guó)家參比室將我室結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果進(jìn)行比較,反饋我室比對(duì)測(cè)試結(jié)果。1.5藥敏試驗(yàn)的敏感性(1)藥敏試驗(yàn)的敏感性:參加評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢出真正耐藥的能力,指檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢出的耐藥菌株占真正耐藥菌株數(shù)百分比;(2)藥敏試驗(yàn)的特異性:參加評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢出真正敏感的能力,指檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢出的敏感菌株占真正敏感菌株數(shù)百分比;(3)藥敏試驗(yàn)的符合率:又稱一致性,指與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相比,檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室得出正確結(jié)果數(shù)與總試驗(yàn)菌株數(shù)的百分比,反映實(shí)驗(yàn)室整體檢測(cè)能力。1.6評(píng)估指標(biāo)按WHO要求,符合率INH及RFP至少應(yīng)達(dá)到90.0%以上,SM和EMB至少應(yīng)達(dá)到80%以上。1.7統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)錄入采用EXCEL,運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1sm與emb檢測(cè)3次比對(duì)結(jié)果顯示,INH和RFP的敏感性結(jié)果均保持在100%;SM分別由87%、92%提高到100%,平均為93%;EMB由50%、63%提高到83%,平均為69%。4種藥物之間敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。2.2sm與emb比例3次比對(duì)結(jié)果顯示,RFP的特異性均保持在100%;INH的特異性分別為96%、100%和92%,平均為96%;SM分別由80%、94%提高到100%,平均為91%;EMB分別為100%、100%和96%,平均為99%。4種藥物之間特異性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。2.34sm與emb分別3次比對(duì)結(jié)果顯示,RFP的符合率均保持在100%,INH的符合率分別為97%、100%和97%,平均為98%;SM分別由83%、93%提高到100%,平均為92%;EMB分別為97%、90%和93%,平均為93%。4種藥物之間符合率均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。2.4耐藥株和敏感株配比2008年下發(fā)的30株菌中,耐EMB和耐RFP的菌株分別只有2株。3年間合計(jì)下發(fā)90株菌,INH耐藥株和敏感株配比為13∶17,SM耐藥株和敏感株配比為1,EMB耐藥株和敏感株配比為8∶37,RFP耐藥株和敏感株配比為2∶7。見表4。2.5耐藥株和敏感株的測(cè)定我們將3次比對(duì)試驗(yàn)的每一株菌的檢測(cè)結(jié)果和國(guó)家參比室反饋的結(jié)果一一進(jìn)行比較,對(duì)4種藥物分別計(jì)算耐藥株和敏感株,國(guó)家共計(jì)下發(fā)121株耐藥菌,我們檢出113株,耐藥預(yù)期值為93%;下發(fā)239株敏感菌中我們檢出232株,敏感預(yù)期值為97%。敏感預(yù)期值顯著高于耐藥預(yù)期值(P<0.01)。見表5。3藥物敏感性檢測(cè)由于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜,每一個(gè)環(huán)節(jié)都存在一定的影響因素,為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,及時(shí)發(fā)現(xiàn)存在的問(wèn)題,提高檢測(cè)效率,預(yù)防較大誤差的發(fā)生,實(shí)驗(yàn)室常常實(shí)施質(zhì)量控制工作,實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制又分為室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量控制兩部分。室間質(zhì)量控制常稱為室間質(zhì)量評(píng)價(jià),它對(duì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室整體水平進(jìn)行評(píng)估,衡量實(shí)驗(yàn)室的整體工作質(zhì)量,并不是對(duì)某個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的操作進(jìn)行評(píng)價(jià)。長(zhǎng)期以來(lái),室間質(zhì)量評(píng)價(jià)一直都是臨床實(shí)驗(yàn)室和公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證的重要組成部分。室間質(zhì)量評(píng)價(jià)常通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來(lái)完成,按照實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證認(rèn)可對(duì)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的定義,實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是指按照預(yù)先規(guī)定的條件,由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同或類似被測(cè)物品進(jìn)行檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)的活動(dòng)。在全國(guó)疾病預(yù)防控制體系結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)中,由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比室,組織實(shí)施省級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)工作?？菇Y(jié)核藥物敏感試驗(yàn)方法有很多種,我國(guó)曾大力推廣使用絕對(duì)濃度法,隨著跨國(guó)之間的聯(lián)系越來(lái)越密切,為與世界接軌,現(xiàn)全國(guó)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室已全面使用世界衛(wèi)生組織推薦的比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性。我省結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室從2008年開始運(yùn)用比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的敏感性,時(shí)間較短,因此在運(yùn)用比例法檢測(cè)抗結(jié)核藥物敏感性的熟練度上尚存不足。常規(guī)的藥敏實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)能夠顯著地提高實(shí)驗(yàn)室的藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量。3次比對(duì),INH的敏感性均為100%,特異性平均為96%,符合率平均為98%;SM的敏感性平均為93%,特異性平均為91%,符合率平均為92%;EMB的敏感性平均為69%,特異性平均為99%,符合率平均為93%;RFP的敏感性、特異性、符合率均為100%。4種藥物之間除敏感性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)外,特異性和符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。我們發(fā)現(xiàn),在4種一線抗結(jié)核藥物的檢測(cè)過(guò)程中,我室RFP和INH的穩(wěn)定性好于SM和EMB,在不斷試驗(yàn)的過(guò)程中,SM和EMB的敏感性檢測(cè)結(jié)果也得到逐步提高。由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢,藥敏試驗(yàn)的操作步驟繁雜,影響因素多,在常規(guī)的操作過(guò)程中,我們不斷分析藥敏試驗(yàn)的每一個(gè)操作步驟,從藥品質(zhì)量、藥敏培養(yǎng)基的制作、培養(yǎng)基凝固溫度的控制、菌液稀釋時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)比濁管的比較,標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑取菌量等環(huán)節(jié)做好室內(nèi)質(zhì)量控制,從而不斷提高了藥敏試驗(yàn)的質(zhì)量,在大多操作環(huán)節(jié)得到控制的條件下,我們將重點(diǎn)放在了磨制菌懸液和菌液的挑取操作上。由于結(jié)核桿菌的菌落干燥、不易乳化,菌落是否被充分地磨散成單個(gè)細(xì)菌的操作,以及標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)挑取菌量的多少直接影響結(jié)果判斷。比對(duì)結(jié)果顯示,我室敏感預(yù)期值為97%,耐藥預(yù)期值為93%,敏感的預(yù)期值高于耐藥預(yù)期值,無(wú)論國(guó)際還是國(guó)內(nèi)都存在這個(gè)問(wèn)題,根本原因在于檢測(cè)人員在操作中接種菌量過(guò)大所致。由于2008年國(guó)家下發(fā)的30株菌株中,只有2株耐EMB,我室只正確檢出1株,因此,一旦有1株未檢出,對(duì)敏感性的檢測(cè)結(jié)果影響較大,占50%。由于同一株菌需對(duì)不同的藥物耐藥或敏感,因此,在選擇菌株時(shí),存在一定的困難,需全盤考慮對(duì)每種藥物的耐藥數(shù)、敏感數(shù)配比問(wèn)題,否則會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。在總數(shù)定為30株的測(cè)試株中,如果耐藥和敏感各占15株左右,1株出現(xiàn)檢測(cè)錯(cuò)誤,所占的權(quán)重較輕,這樣才不會(huì)對(duì)敏感性、特異性、一致性造成較大影響。從3年下發(fā)的菌株中,我們可以看出INH、SM的耐藥菌、敏感菌匹配較為合理。雖然我室每次比對(duì)檢測(cè)結(jié)果符合