利用果皮生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑的研究

利用果皮生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑的研究

植物線蟲(chóng)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)“世界增長(zhǎng)約占世界增長(zhǎng)的5%”，全國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年減少約23億株。盡管化學(xué)預(yù)防有一定的效果，但也存在許多問(wèn)題。例如，高價(jià)格、對(duì)外貿(mào)易、容易造成農(nóng)產(chǎn)品污染和污染。因此，農(nóng)業(yè)控制是必然趨勢(shì)。土壤中的線蟲(chóng)受到許多生物因素的影響，而吃蟲(chóng)基質(zhì)是自然條件下抑制線蟲(chóng)的主要因素。首先，考慮到了柳綠線和綠線的關(guān)系。jatala等人在秘魯發(fā)現(xiàn)了以南綠帶（1979年）的卵，并成為許多植物線蟲(chóng)的內(nèi)生菌。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外的研究日益增多。一些國(guó)家的研究正在推遲。明朝太祖、劉興忠、馬成旭和潘桑東先后對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)行了研究?，F(xiàn)在，我們正在控制和實(shí)現(xiàn)中國(guó)制造的原料細(xì)菌，并取得了令人滿意的進(jìn)展。為了進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，必須考慮到工業(yè)成本，生物殺蟲(chóng)劑的制備需要考慮到上述材料產(chǎn)生的細(xì)菌直徑和細(xì)胞大小的生物學(xué)特性，并對(duì)其進(jìn)行藥物試驗(yàn)。同時(shí)，我們還進(jìn)行了藥物試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果如表所示。1材料和方法1.1pl4910菌株和不同浴場(chǎng)的水果品種本實(shí)驗(yàn)所用的淡紫擬青霉菌種是作者1994年從廈門番茄根部寄生的南方根結(jié)線蟲(chóng)卵塊中分離得到的Pl9410菌株,淘米水取自廈門大學(xué)學(xué)生食堂,西瓜皮、香蕉皮、菠蘿皮等從海濱浴場(chǎng)的水果攤上拾獲.1.2不同培養(yǎng)基的制備1.2.1培養(yǎng)基ph值的確定把菠蘿皮、香蕉皮、西瓜皮等各種果皮切碎,加少量水,投入高速組織搗碎機(jī)內(nèi)打漿(轉(zhuǎn)速12000r/min,3次,每次3min,間歇5min),用兩層紗布過(guò)濾,濾液按1.5%~2.0%的比例加入瓊脂,溶解后分裝于試管或茄子瓶中,高壓滅菌后制成斜面,菠蘿皮制的培養(yǎng)基pH值要調(diào)到7.0左右.1.2.2小麥粉培養(yǎng)基的制備靜置一段時(shí)間后傾去上清液,沉淀液用比重計(jì)測(cè)定為1.4Be左右,按每瓶100mL分裝振蕩燒瓶中,經(jīng)高壓滅菌后接種淡紫擬青霉的一級(jí)培養(yǎng)物.淘米水也可以按上述比例加瓊脂制成斜面培養(yǎng)基.1.3平板均制備和日生長(zhǎng)量測(cè)定把1.2.1配制好的各種固體培養(yǎng)基按每管20mL分裝于試管,高壓滅菌后按無(wú)菌操作倒入滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板,然后用首尾劃線法把淡紫擬青霉接種到平板上,28℃培養(yǎng)7d后測(cè)量單個(gè)菌落的大小,并計(jì)算平均日生長(zhǎng)量.平均日生長(zhǎng)量=菌落大小/天數(shù).繼續(xù)培養(yǎng)7d后,再測(cè)量菌落大小和孢子大小.1.4菌落總數(shù)的測(cè)定把已經(jīng)配好的PDA培養(yǎng)基分裝,20mL/管,高壓滅菌,培養(yǎng)皿若干包裝滅菌備用.精確稱取菌劑樣品1g,準(zhǔn)至0.0002g,按無(wú)菌操作法放入裝有25粒5號(hào)玻璃珠的三角燒瓶中,量取無(wú)菌蒸餾水100mL加入三角燒瓶,塞上棉花塞,康氏振蕩器(200次/min)振搖20min后靜止片刻,即為10-2孢子懸浮液(第1次稀釋);吸取上述10-2孢子懸浮液1.0mL,注入第2個(gè)帶同樣玻璃珠的三角燒瓶中,加入99mL滅菌蒸餾水,塞上棉花塞,同上振搖20min,即為10-4孢子懸液(第2次稀釋),如此一直稀釋至10-8孢子懸浮液(即為第4次稀釋),或者從10-6孢子懸浮液中吸取1.0mL注入21mm×180mm的試管,加入9.0mL的無(wú)菌蒸餾水,搖勻成10-7孢子懸浮液.將加熱融化并冷卻至55℃左右的培養(yǎng)基,放在水浴鍋中52℃保溫待用.將上面稀釋好的兩種濃度孢子懸浮液,按無(wú)菌操作要求各吸取1.0mL注入滅菌過(guò)的培養(yǎng)皿中,每種濃度重復(fù)5個(gè)培養(yǎng)皿,并立即把已融化好待用的培養(yǎng)基按每個(gè)平板20mL分注,迅速正向和反向旋轉(zhuǎn)平板3次,使菌體與培養(yǎng)基充分混合攤布均勻,平放靜置30min.待凝固好,把培養(yǎng)皿倒扣過(guò)來(lái),置28℃恒慍箱內(nèi)培養(yǎng)3~4d.等長(zhǎng)出淡紫擬青霉菌落時(shí),從培養(yǎng)箱取出平板,馬上用記號(hào)筆計(jì)數(shù)淡紫色菌落數(shù).樣品的成菌落單位CFU(個(gè)/g)按下式計(jì)算:CFU=ε×h1式中:CFU為1g菌劑所含的成菌落單位ε為同稀釋度5個(gè)培養(yǎng)皿的菌落平均數(shù)h1為樣品的稀釋倍數(shù)1.5根結(jié)線卵蟲(chóng)種的制備直徑17cm,深度17cm的小花盆5個(gè),每盆裝沃土1600mL,經(jīng)濕熱滅菌后分別接種用淘米水振蕩培養(yǎng)、剩面條擴(kuò)大培養(yǎng)的菌劑,接種劑量分別為0.1g,0.2g,0.4g和0.8g,另設(shè)一盆對(duì)照.3d后每盆各接種根結(jié)線蟲(chóng)卵306粒,各移入番茄苗2株,夏季室外培育50d后翻盆,洗凈根系解剖蟲(chóng)體.2結(jié)果2.1剩下的食物和三種果皮使用壽命來(lái)吸收紫外和綠霉淡紫擬青霉在以剩飯、西瓜皮、香蕉皮和菠蘿皮制成的培養(yǎng)基上以及PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1.2.2細(xì)菌劑的最終單位為用淘米水等食堂廢料制成的4批淡紫擬青霉菌劑CFU測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.2.3測(cè)定細(xì)菌劑的療效接種用淘米水-剩面條培養(yǎng)的菌劑在室外生長(zhǎng)50d的番茄解剖結(jié)果見(jiàn)表3.3討論3.1各種果皮的生長(zhǎng)狀況及其對(duì)人才培養(yǎng)的影響從表1可以看出,用剩飯和西瓜皮、菠蘿皮、香蕉皮等多種果皮制成的培養(yǎng)基,淡紫擬青霉都能在其上生長(zhǎng),但菌落的生長(zhǎng)情況有所不同.剩飯培養(yǎng)基培養(yǎng)的淡紫擬青霉,其生物學(xué)特性,包括孢子大小、平均日生長(zhǎng)量和菌落大小,都明顯地比PDA上培養(yǎng)的要好.西瓜皮上的平均日生長(zhǎng)量和菌落大小,明顯地比PDA上培養(yǎng)的大,只是孢子質(zhì)量不如PDA上培養(yǎng)的好;而香蕉皮和菠蘿皮上培養(yǎng)的則明顯比PDA上培養(yǎng)的差.此兩種果皮相比較,菠蘿皮上培養(yǎng)的平均日生長(zhǎng)量要好一些,而香蕉皮上培養(yǎng)的孢子稍大一些.上述試驗(yàn)結(jié)果表明,用食堂下泔和各種果皮做原料生產(chǎn)淡紫擬青霉菌劑具有巨大潛力.福建地處亞熱帶,水果資源十分豐富.根據(jù)統(tǒng)計(jì)資料,1994年廈門市水果總產(chǎn)量28.06萬(wàn)t(不含西瓜),其中菠蘿538t,香蕉9563t.此外,西瓜3012t.1994年福建省水果總產(chǎn)量153.75萬(wàn)t(不含西瓜),其中菠蘿26501t,香蕉301290t.此外,西瓜381657t.縱然按10kg果產(chǎn)生1kg果皮,10kg果皮制造1kg菌劑計(jì)算,縱然只有一半的果皮得到利用,哪怕是1/4,都是一筆很可觀的數(shù)字.本文僅僅是廢棄物利用方面的一個(gè)初步探討,雖然各種果皮培養(yǎng)的效果各不一樣,但可以預(yù)料:(1)如果把幾種廢料混合,可能提高培養(yǎng)效果,因?yàn)槊恳环N廢料所含的營(yíng)養(yǎng)成份不一樣,有的成份有利于菌絲生長(zhǎng)(碳源),有的有利于孢子生長(zhǎng)(氮源).培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的技巧在于合理地掌握碳氮比.由于時(shí)間限制,本文沒(méi)有就此繼續(xù)探討,這方面的工作今后還要進(jìn)行.(2)本項(xiàng)研究旨在利用食堂廢棄物,嚴(yán)格限定為不得添加其他原料(農(nóng)副產(chǎn)品及微量元素等),若添加其它原料,當(dāng)可進(jìn)一步提高培養(yǎng)效果,今后還要繼續(xù)試驗(yàn).3.2篩選用于干燥用淘米水等食堂廢料制成的4批淡紫擬青霉菌劑,每克樣品的CFU都達(dá)到109,完全達(dá)到作為真菌菌劑所要求的CFU,甚至超過(guò).馬承鑄和作者制造的菌劑,CFU都在106~107,前者是用玉米粉和麥皮,后者是用啤酒渣等廢料制成.而本試驗(yàn)是以淘米水做振蕩培養(yǎng),接著的固體發(fā)酵無(wú)論是用三合土(玉米粉∶麥皮∶干土=1∶1∶1),還是剩面條,每克菌劑的活孢子數(shù)都達(dá)到109,CFU是目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的菌劑的10~100倍.這說(shuō)明淘米水是一種優(yōu)良的培養(yǎng)料,完全可以用來(lái)取代常規(guī)的玉米粉和麥皮.淘米水養(yǎng)分豐富,可就近取材作為振蕩培養(yǎng)的物料,只須量取,不必稱重,使用方便.據(jù)調(diào)查,僅廈門大學(xué)一所學(xué)校公共食堂每天用米就達(dá)3000kg左右,即使按10∶1的比例計(jì)算(即10kg米淘出1kg水),每天可產(chǎn)生300kg淘米水;按實(shí)驗(yàn)室搖瓶法生產(chǎn)計(jì)算,可裝3000個(gè)燒瓶振蕩培養(yǎng)(每瓶100mL),約可生產(chǎn)600kg淡紫擬青霉菌劑.廈門市總?cè)丝?17萬(wàn),若可收取半數(shù)人口的淘米水,每天約有30000kg淘米水,可生產(chǎn)130t淡紫擬青霉菌劑.現(xiàn)在這些淘米水不加以利用,任其順下水道流入港灣,使海水富營(yíng)養(yǎng)化,時(shí)下已經(jīng)出現(xiàn)的赤潮等問(wèn)題可能與此不無(wú)關(guān)系.所以,利用淘米水生產(chǎn)淡紫青霉等生物殺線蟲(chóng)劑,不但能為農(nóng)業(yè)解決普遍存在的線蟲(chóng)病害問(wèn)題,也會(huì)給治理環(huán)境污染帶來(lái)好處.3.3最佳施0.8g與不用藥對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)表3,從藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,在0.1~0.8g的范圍內(nèi),用淘米水、剩面條制造的菌劑,隨著施用劑量的增加,蟲(chóng)口密度有較大輻度的減少,每1600mL土壤施0.8g效果最佳,施0.8g與不施藥對(duì)比,根瘤形成程度減少4級(jí),蟲(chóng)癭減少98.0%,卵塊減少92.3%,雌蟲(chóng)減少97.7%.施0.