異種動(dòng)物ig免疫白兔實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

異種動(dòng)物ig免疫白兔實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.器材：剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子（游離血管用）一把、直頭眼科手術(shù)剪（剪血管用）一把，手術(shù)刀架，手術(shù)刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩把，手術(shù)縫合線，塑料放血管，紗布等。試劑：生理鹽水（或PBS），弗氏完全佐劑（Freund'scompleteadjuvant,FCA）SigmaF-5881，弗氏不完全佐劑（Freund'sincompleteadjuvant,FIA）SigmaF-5506，二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2%NaN3兔子的選擇：兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動(dòng)脈，健康。Pre-bleeding：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體時(shí)作為陰性對(duì)照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時(shí)間，可以進(jìn)行耳動(dòng)脈取血。取血量約5ml足矣。免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量。抗原經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，但若乳化不充分，會(huì)影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。免疫方法可采用背部多點(diǎn)注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射，每點(diǎn)注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)注射（不要選擇臨近位點(diǎn)，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100四。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。免疫一周后，可以耳動(dòng)脈取血檢測抗體效價(jià)。因?yàn)槠鸪鯉状蚊庖弋a(chǎn)生的抗體的效價(jià)比較低，頭兩次取血，夠檢測用即可。在三次免疫后，可以獲得較高效價(jià)的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(huì)造成兔子貧血。最后一次取血可以采用頸動(dòng)脈放血，具體操作如下：家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚；沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約10cm，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮?，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織；于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾?。挥眯∧粗笁|在血管下，用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；松開止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。血清的分離：如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集,37oC烘箱放置2hr,轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。多克隆抗體制備（一） 多克隆抗體制備原理多克隆抗體的概念多克隆抗體：在含有多種抗原決定簇的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)多種不同表位的單克隆抗體，其混和物為多克隆抗體。機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生多克隆免疫血清實(shí)質(zhì)上是由多種抗體組成的混合物，又稱多克隆抗體。多克隆抗體產(chǎn)生原理初次反應(yīng)的抗體持續(xù)時(shí)間較短，親和力也較低，多無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。機(jī)體初次接觸抗原后，激發(fā)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在Mø和Th的作用下，B細(xì)胞被激活，增生分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞（Bm）。漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。由于初次反應(yīng)時(shí)，只有少量對(duì)該抗原特異的免疫活性細(xì)胞被誘導(dǎo)而增生分化為漿細(xì)胞。隨著抗原的消耗，抑制T細(xì)胞（Tc）的激活和循環(huán)抗體的反饋抑制作用，漿細(xì)胞減少，抗體滴度很快下降。二次反應(yīng)產(chǎn)生的抗體主要是高親和力的IgG。機(jī)體再次受同一抗原刺激后，對(duì)該抗原特異性的Bm迅速增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。Th的記憶細(xì)胞也加快反應(yīng)的進(jìn)行，在抗原作用1~2天后，抗體滴度迅速上升?？贵w合成率為初次反應(yīng)的幾倍到幾十倍。多克隆抗體制備方法流程純化的抗原f與弗氏佐劑一起充分乳化f注射動(dòng)物體內(nèi)（劑量，次數(shù)，途經(jīng)等均要適宜I測定效價(jià)（如效價(jià)高，則不必加強(qiáng)免疫）f1周后經(jīng)動(dòng)脈放血f分離血清f純化抗血清備用。（二） 材料與試劑提取的動(dòng)物Ig弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑3.青霉素和鏈霉素實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔其它材料及試劑（三） 操作方法免疫方法可以采用以下各種方法之一進(jìn)行免疫。（1）淋巴結(jié)注射法:①在兔的兩后足跖部皮下（或皮內(nèi)）注射活卡介苗50mg（每側(cè)約0.30ml）。7?10天后，兔跖及腘肌淋巴結(jié)腫大；②于腫大的兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000〃g/ml；）③必要時(shí)，14天后，重復(fù)步驟②一次；④再過7天后，于兩側(cè)淋巴結(jié)內(nèi)各注射加有完全佐劑的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素1000U/ml、鏈霉素1000pg/ml）；⑤5?7天后，耳靜脈采血。測定血清效價(jià)。（2） 皮下多點(diǎn)注射法：①家兔兩側(cè)掌（跖內(nèi)各注射含有完全佐劑抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）；②7?10天后，脊柱兩側(cè)多點(diǎn)（頸、胸、腰椎各兩點(diǎn)、共6點(diǎn)）皮下注射含不完全佐劑的抗原，每點(diǎn)0.50ml；③7?10天后，脊柱兩側(cè)重復(fù)注射一次；④7?10天后試血。不合格者重復(fù)步驟③。（3） 多途徑聯(lián)合注射法：①兩側(cè)掌（跖）內(nèi)側(cè)皮下注射含完全佐劑抗原0.50ml（IgG量為5mg/ml）；②14天后，多點(diǎn)皮下注射含有不完全佐劑抗原；③7天后，耳靜脈注射不含佐劑的抗原2ml；④測定血清抗體效價(jià)，不合格者重復(fù)步驟③，并適當(dāng)遞增IgG量。效價(jià)測定采用瓊脂擴(kuò)散法。⑴將血清倍比稀釋，加入外周孔。⑵中間孔加動(dòng)物Ig。⑶37°C濕盒瓊擴(kuò)24小時(shí)，觀察結(jié)果。（四）結(jié)果判定1.抗Ig的效價(jià)測定瓊脂擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1：16或1：32者為合格。2.純度鑒定采用瓊擴(kuò)法。中間孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和標(biāo)準(zhǔn)品Ig。在抗Ig與Ig以及標(biāo)準(zhǔn)品Ig均出現(xiàn)一條沉淀線，且這兩條沉淀線相互融合者，說明提取的Ig是純的。多克隆抗體制備原理1多克隆抗體的概念多克隆抗體：在含有多種抗原決定簇的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)多種不同表位的單克隆抗體，其混和物為多克隆抗體。機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生多克隆免疫血清實(shí)質(zhì)上是由多種抗體組成的混合物，又稱多克隆抗體。2多克隆抗體產(chǎn)生原理初次反應(yīng)的抗體持續(xù)時(shí)間較短，親和力也較低，多無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。機(jī)體初次接觸抗原后，激發(fā)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在Mø和Th的作用下，B細(xì)胞被激活，增生分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞（Bm）。漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。由于初次反應(yīng)時(shí)，只有少量對(duì)該抗原特異的免疫活性細(xì)胞被誘導(dǎo)而增生分化為漿細(xì)胞。隨著抗原的消耗，抑制T細(xì)胞（Tc）的激活和循環(huán)抗體的反饋抑制作用，漿細(xì)胞減少，抗體滴度很快下降。二次反應(yīng)產(chǎn)生的抗體主要是高親和力的IgG。機(jī)體再次受同一抗原刺激后，對(duì)該抗原特異性的Bm迅速增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體。Th的記憶細(xì)胞也加快反應(yīng)的進(jìn)行，在抗原作用1~2天后，抗體滴度迅速上升?？贵w合成率為初次反應(yīng)的幾倍到幾十倍。（一）抗原的制備與純化1顆粒抗原制備細(xì)胞抗原：自然界中某些細(xì)胞組分的抗原性不僅取決于組成它的蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，有時(shí)也要求完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)。將細(xì)胞組分整體分離直接免疫動(dòng)物會(huì)得到事半功倍的效果。利用細(xì)胞個(gè)組分質(zhì)量大小的不同，通過密度梯度離心的方法，在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中，各組分沉降于離心管內(nèi)的不同區(qū)域，分別收集，即可得到所需組分。細(xì)菌類抗原：細(xì)菌類抗原首先應(yīng)該選好免疫用菌株，在適宜條件下培養(yǎng)增殖，刮取菌苔，經(jīng)殺菌后稀釋成適當(dāng)濃度作為抗原液。2可溶性抗原制備與純化可溶性抗原包括蛋白質(zhì)、多肽、脂蛋白、鐵蛋白、類脂、糖蛋白、細(xì)菌毒素、酶、補(bǔ)體等均為良好的抗原。為制備特異性高的抗血清一般均需加以純化?？乖兓Ｓ玫姆椒ǎ褐行喳}沉淀法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、免疫吸附親和層析法。3半抗原的免疫原制備法半抗原：多肽，甾族激素，藥物，脂肪胺，核苷等小分子物質(zhì)僅能與相應(yīng)的抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，而它們本身并不是免疫原，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。半抗原免疫原制備：將小分子半抗原制備成免疫原通常可用物理吸附方法和化學(xué)方法。物理吸附方法：通過電荷和微孔吸附半抗原。物理吸附劑有：碳粉，聚乙，葡聚糖硫酸鈉，甲基纖維素等?；瘜W(xué)方法：應(yīng)用某些功能團(tuán)試劑把半抗原連接到載體上。載體：包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲狀腺球蛋白，血藍(lán)蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚賴酸等。半抗原結(jié)合到載體上的數(shù)目直接與抗體生成有關(guān)，半抗原連接在載體上的數(shù)目至少有20個(gè)以上，才能有效地產(chǎn)生抗體。（二）抗原純度的鑒定方法蛋白質(zhì)抗原純化以及抗血清制備后均需作純度鑒定，通常采用的鑒定方法有：1、醋酸纖維薄膜電泳，此法可以初步鑒定抗原純度，不需要抗血清，較為方便。2、SDS，是鑒定純度最為常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以從樣品的泳動(dòng)率初步了解其分子量。還可以和標(biāo)準(zhǔn)樣品相比較，對(duì)各電泳區(qū)帶的物質(zhì)加以定型。3、雙向瓊脂擴(kuò)散法，是鑒定抗原純度最為簡單的方法，主要是通過各種特異性抗血清鑒定抗原純度，首先必須有抗體才能用這一方法。（三） 免疫佐劑1佐劑的概念和種類佐劑的概念：佐劑是非特異性的免疫增強(qiáng)劑，有些物質(zhì)與抗原一起或預(yù)先注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。佐劑的種類：1） 微生物及其產(chǎn)物：如分枝桿菌（結(jié)核桿菌、卡介苗）短小棒狀桿菌、白日咳桿菌、革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素。2） 無機(jī)化合物：氫氧化鋁、明磯等3） 合成佐劑：如雙鏈多聚肌胞苷酸（polyI:C）4） 油劑：如弗氏佐劑、礦物油、植物油2佐劑的生物學(xué)作用增加抗原的免疫原性，使無或微弱免疫原物質(zhì)變成有效的免疫原；提高抗體的滴度，提高初次免疫應(yīng)答和再次免疫應(yīng)答抗體的滴度；改變抗體的類型，由產(chǎn)生IgM轉(zhuǎn)變成IgG；引起或增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。3佐劑的作用機(jī)制改變抗原物理性狀，延緩抗原降解和排除，延長體內(nèi)存留的時(shí)間，從而更有效的刺激免疫系統(tǒng)；刺激單核巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其對(duì)抗原的處理和遞呈能力；刺激淋巴細(xì)胞增生和分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)。4弗氏佐劑弗氏不完全佐劑（IFA）石蠟油+羊毛脂弗氏完全佐劑（CFA）石蠟油+羊毛脂+卡介苗抗原和佐劑的比例為1：1，由于佐劑是油劑，加抗原后要充分混合成乳劑。（四） 動(dòng)物的選擇1動(dòng)物的種類和種系：供免疫用的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動(dòng)物的免疫應(yīng)答受動(dòng)物的遺傳基因影響，同一種系的動(dòng)物對(duì)不同抗原的免疫應(yīng)答和不同種系的動(dòng)物對(duì)同一抗原的免疫應(yīng)答均不盡相同。抗原的來源與免疫動(dòng)物的親緣較遠(yuǎn)，產(chǎn)生的抗體效價(jià)高，同種系或親緣較近，產(chǎn)生的抗體的效價(jià)就差。2動(dòng)物的生理狀況：由于個(gè)體差異的存在，同一抗原免疫同一種系不同個(gè)體的動(dòng)物，產(chǎn)生的抗體的效價(jià)有很大的差異。與動(dòng)物的年齡和營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。免疫用的動(dòng)物最好選擇適齡的健康雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物特別是妊娠動(dòng)物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時(shí)甚至不產(chǎn)生抗體。3抗血清的需要量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)中抗血清的需要量，選用最經(jīng)濟(jì)的動(dòng)物和免疫動(dòng)物的只數(shù)。一般實(shí)驗(yàn)室采用的抗體，多用兔和羊制備。（五）動(dòng)物的免疫1抗原劑量：抗原的免疫劑量應(yīng)根據(jù)抗原的免疫原性強(qiáng)弱、抗原來源難易、動(dòng)物的種類、免疫周期等來選擇抗原劑量。免疫劑量過低，不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激，免疫劑量過多，有可能引起免疫耐受。在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價(jià)是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質(zhì)抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般情況下，小鼠的首次免疫劑量為50pg?400^g/次，大鼠為100pg?1000pg/次，家兔為500pg?1000pg/kg/次，加強(qiáng)劑量為首次劑量的1/2?1/3。2注射途徑：抗原的進(jìn)入途徑?jīng)Q定了抗原吸收、分布和代謝的速度。吸收越快，分解代謝越快，對(duì)機(jī)體影響的時(shí)間越短。吸收越快，單位時(shí)間的有效抗原量就越大，機(jī)體的免疫應(yīng)答就越強(qiáng)，毒副作用也越強(qiáng)。根據(jù)免疫應(yīng)答過程中各階段的特點(diǎn)，選擇注射途徑。常用的途徑有：靜脈、脾臟、淋巴結(jié)、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、掌內(nèi)、跖內(nèi)皮下。對(duì)抗原吸收的速度：靜脈二脾臟二淋巴結(jié)〉腹腔〉肌肉〉皮下〉皮內(nèi)〉掌內(nèi)二跖內(nèi)皮下?；A(chǔ)免疫應(yīng)選擇緩慢吸收的途徑，延長抗原刺激時(shí)間。3加強(qiáng)免疫時(shí)間：與抗原的理化性質(zhì)、劑量、進(jìn)入途徑、機(jī)體狀況和所處的免疫應(yīng)答階段有關(guān)?？乖砘再|(zhì)穩(wěn)定，吸收分布速度慢或機(jī)體處于免疫應(yīng)答的早期，應(yīng)延長間隔時(shí)間。兩次注射的間隔時(shí)間應(yīng)長短適宜，太短起不到再次反應(yīng)的效果，太長則失去了前一次激發(fā)的敏感作用。一般情況下，第一次加強(qiáng)免疫應(yīng)在基礎(chǔ)免疫后的23周，以后每710天加強(qiáng)一次。加佐劑間隔時(shí)間應(yīng)為2周左右。注射的Ig純度高，則一般不易引起過敏反應(yīng)，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時(shí)，極易引起過敏反應(yīng)，所以一定要采取措施。4加強(qiáng)免疫次數(shù)：抗原的免疫原性強(qiáng)弱和動(dòng)物對(duì)抗原的敏感性有關(guān)?？乖庖咴匀酰瓒啻渭訌?qiáng)才能獲滿意的抗血清。得制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法需要獲得高效價(jià)的抗血清，宜采用大劑。量長程免疫法。免疫周期長者，可少量多次。免疫周期短者，應(yīng)大量少次。最簡單的方法是直接檢測血清中的抗體滴度，觀察免疫效果。5佐劑應(yīng)用：加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對(duì)家兔而言，采用弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg?1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐劑則