青蒿素對人白血病U937細(xì)胞凋亡及分化的影響(全文)

精品文檔-下載后可編輯青蒿素對人白血病U937細(xì)胞凋亡及分化的影響(全文)：薄劍，王文清，王全順，李紅華，趙瑜，吳曉雄，達(dá)萬明，于力

【摘要】目的：通過青蒿素對經(jīng)典人白血病細(xì)胞系u937的作用研究，探索青蒿素治療白血病的可能.方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)、四唑鹽比色試驗(yàn)（mtt）、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、dna電泳及nbt還原試驗(yàn)等方法觀察不同濃度青蒿素促進(jìn)u937細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)分化作用.結(jié)果：青蒿素在濃度6μmol/l時(shí)可顯著抑制u937細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)(p0.01)；在誘導(dǎo)分化濃度下,青蒿素可促進(jìn)u937細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化(p0.01).結(jié)論：青蒿素對白血病細(xì)胞u937的選擇性促凋亡作用以及誘導(dǎo)分化效應(yīng)表明其可能是一種理想的高效低毒抗白血病藥物，有望進(jìn)入臨床應(yīng)用.

【關(guān)鍵詞】青蒿素類；白血?。籾937細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞分化

【abstract】aim:toinvestigatetheeffectsofartemisininonapoptosisanddifferentiationofclassichumanacutemonoblasticleukemiacelllineu937andtostudythepossibilityoftreatmentofleukemiawithartemisinin.methods:thecytotoxicactivityofartemisininonu937cellswasdetectedbymeansofmttassay.apoptosiswasidentifiedandanalyzedwithtransmissionelectronmicroscopy,cellcycle,anddnagelelectrophoresis.thedifferentiationofu937cellsintomorematuregranulocyteswasdetectedbynitrobluetetrazolium(nbt)reductiontest.results:differentconcentrationsofartemisinincouldsuppresstheproliferationandinducedtheapoptosisofu937cellsinadosedependent(6μmol/l)andtimedependent(1-6d,p0.01)manner.thedatafromnbtreductiontestdemonstratedthatu937cellswereinducedtodifferentiateintomorematuregranulocytesbylowdosegossypol(2-5μmol/l,p＜0.01).conclusion:artemisininselectivelyinducesapoptosisofleukemiau937cellsinasmallerdosethanthatforhumanperipheralbloodmononuclearcells(thecontrolgroup).itsuggeststhatartemisininmaybeanidealdrugforleukemiatherapyafteraseriesofpreclinlicandclinlicresearches.

【keywords】artemisinins;leukemia;u937cells;cellproliferation;apoptosis;celldifferentiation

0引言

近年來，白血病發(fā)病率有顯著升高的趨勢［1］，目前，對于此類疾病的治療仍主要采取傳統(tǒng)的化療手段，其顯著的毒副作用使得患者的生活質(zhì)量和治療信心受到嚴(yán)重影響.因此，尋找高效低毒的治療藥物，顯得非常重要.青蒿素最初以顯著的抗瘧原蟲效應(yīng)、簡單易處理等作用為人們所熟知，隨后進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，包括抗心律失常，抑制腫瘤生長等，特別是后者，已經(jīng)成為近年青蒿素研究熱點(diǎn)之一［2］.青蒿素對于很多實(shí)體瘤細(xì)胞，如肝癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等細(xì)胞具有顯著的殺傷作用［3-4］.但有關(guān)青蒿素對白血病細(xì)胞的殺傷效應(yīng)以及有無臨床使用價(jià)值等問題的研究還少見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)通過青蒿素對經(jīng)典的白血病u937細(xì)胞系進(jìn)行研究，觀察其對u937細(xì)胞增殖、分化的影響，為進(jìn)一步的應(yīng)用研究提供理論依據(jù).

1材料和方法

1.1材料正常人單個(gè)核細(xì)胞（pbmncs）來自總醫(yī)院輸血科正常獻(xiàn)血離心白細(xì)胞層.白血病細(xì)胞系、人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系u937細(xì)胞由本室保存.青蒿素（artemisinin）由廣西桂林制藥廠生產(chǎn)；rpmi1640按說明配制.胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)56℃30min滅活，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?

1.2方法

1.2.1人外周血pbmncs的制備與白血病細(xì)胞的培養(yǎng)［5］將分離的白細(xì)胞層，采用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離,收集單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)rpmi1640培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整到所需細(xì)胞濃度備用.人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系u937細(xì)胞以1×108/l濃度接種于含100ml/l胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，置37℃，50ml/lco2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3～4d傳代1次.

1.2.2試劑的制備青蒿素用9g/l生理鹽水溶解，稀釋成濃度為12.5mmol/l的溶液，過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?，用前繼續(xù)稀釋.四唑氮藍(lán)（mtt）及硝基藍(lán)四氮唑（nbt），分別用10mmol/lpbs配制成溶液，9ml/l生理鹽水配成為2ml/l溶液，過濾除菌，避光4℃保存?zhèn)溆?

1.2.3mtt法檢測細(xì)胞活力①檢測不同濃度青蒿素對人白血病細(xì)胞系u937細(xì)胞作用.青蒿素濃度從100μmol/l開始［4］，以含同樣梯度濃度生理鹽水的prmi1640培養(yǎng)基為平行孔，將u937細(xì)胞以每孔4×104接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μl.培養(yǎng)24h后按倍比稀釋濃度梯度加入青蒿素，繼續(xù)培養(yǎng).每孔加入mtt（5g/l）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，離心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解.酶聯(lián)免疫檢測儀選擇波長490nm處檢測a值.以濃度為橫軸，a值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線［6］.②檢測不同濃度青蒿素對人外周血單個(gè)核細(xì)胞作用.方法同上，接種密度為每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞.

1.2.4超微結(jié)構(gòu)觀察將終濃度為20μmol/l的青蒿素作用于對數(shù)生長期的u937細(xì)胞，作用24h后收獲細(xì)胞，pbs洗滌2次，轉(zhuǎn)移至ep管，1500r/min離心10～15min.40ml/l戊二醛固定，送電子顯微鏡觀察.

1.2.5annexinv檢測終濃度為20μmol/l的青蒿素作用于對數(shù)生長期的u937細(xì)胞，12h后收獲細(xì)胞，冰冷pbs洗滌2次，細(xì)胞以105～106/l的密度重懸.annexinv?fitc和pi各5μl加入490μl的細(xì)胞懸液中，避光室溫作用10min，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測annexinv和pi染色.

1.2.6dna梯度電泳按文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行，終濃度為20μmol/l的青蒿素作用于對數(shù)生長期的u937細(xì)胞，作用24h后收獲細(xì)胞，pbs洗滌2次，裂解緩沖液混勻，加入蛋白酶k56℃消化過夜，酚氯仿抽提，冷乙醇沉淀，te溶解.18g/l瓊脂糖凝膠50v電壓電泳1h，觀察dnaladder的形成情況.

1.2.7wright?giemsa染色根據(jù)mtt實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用2,5μmol/l作為青蒿素誘導(dǎo)分化用濃度.在含100ml/l胎牛血清的rpmi1640，4×107/l的u937細(xì)胞培養(yǎng)體系中，加入不同濃度的青蒿素培養(yǎng)5d，將細(xì)胞離心涂片，wright?giemsa染色，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài).

1.2.8硝基藍(lán)四氮唑還原試驗(yàn)將終濃度2和5μmol/l青蒿素處理的u937細(xì)胞培養(yǎng)1～5d.收集細(xì)胞，以不含血清的rpmi1460洗滌離心，棄上清，每管加入0.5ml的1g/lnbt溶液和0.1mltpa溶液，搖勻,37℃反應(yīng)30～60min.吸取少量細(xì)胞懸液，涂片，空氣干燥，常規(guī)wright?giemsa染色.細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)紫色斑者為陽性.在光學(xué)顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性百分率.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，組間差異采用方差分析，半數(shù)抑制濃度（ic50）采用spss10.0統(tǒng)計(jì)軟件包的概率單位法(probit)計(jì)算.

2結(jié)果

2.1青蒿素對人白血病細(xì)胞系u937細(xì)胞增殖的影響青蒿素＞6μmol/l時(shí)，表現(xiàn)出對u937細(xì)胞明顯的抑制增殖作用，隨著時(shí)間的延長，抑制作用更加明顯.隨著濃度的增加以及時(shí)間的延長,青蒿素對u937細(xì)胞的作用有明顯的增殖趨勢(圖1).

圖1青蒿素對人白血病細(xì)胞系u937細(xì)胞增殖的影響（略）

2.2青蒿素對pbmncs增殖的影響青蒿素＞12μmol/l時(shí)，才對pbmncs表現(xiàn)出明顯的殺傷效應(yīng).其對正常外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用濃度要顯著高于對白血病細(xì)胞作用濃度，提示青蒿素對白血病細(xì)胞存在非常明確的選擇殺傷作用（圖2）.

圖2青蒿素對pbmncs增殖的影響（略）

2.3電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)變化經(jīng)20μmol/l終濃度青蒿素處理24h后的u937細(xì)胞，電鏡結(jié)果可見大量的細(xì)胞表現(xiàn)出染色質(zhì)邊集等凋亡現(xiàn)象（圖3）.

圖3u937細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)×7500（略）

2.4annexinv檢測20μmol/l終濃度青蒿素處理24h后u937細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測annexinv，結(jié)果出現(xiàn)顯著的早期凋亡與晚期凋亡細(xì)胞群（2，4象限）（圖4）.

a：陰性對照細(xì)胞；b：處理細(xì)胞.

圖4annexinv檢測（略）

2.5梯度dna電泳經(jīng)20μmol/l終濃度青蒿素處理24h后，抽提細(xì)胞dna電泳可見明顯的dnaladder形成，提示青蒿素可以誘導(dǎo)u937細(xì)胞凋亡(圖5).

m:100bpmarker;1:20μmol/l濃度青蒿素作用12h后可見少量的ladder;2:20μmol/l濃度青蒿素作用24h后可見明確的ladder.

圖5青蒿素作用后u937細(xì)胞dna電泳圖（略）

2.6青蒿素對u937細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：陰性對照組u937細(xì)胞外形不規(guī)則；核大，染色質(zhì)疏松，可見一個(gè)或多個(gè)核仁，核漿比例大.經(jīng)低濃度青蒿素處理的u937細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生明顯變化，細(xì)胞體積變小，核染色質(zhì)濃縮，核漿比例減小，胞質(zhì)呈灰藍(lán)色，原始細(xì)胞減少.nbt還原試驗(yàn)結(jié)果顯示，2和5μmol/l濃度青蒿素處理的u937細(xì)胞陽性率呈時(shí)間依賴性增高，并與劑量明顯相關(guān)(p0.01).2和5μmol/l濃度青蒿素處理5d的u937細(xì)胞nbt還原試驗(yàn)陽性率分別為43%和57%(p0.01).

2.7青蒿素對u937細(xì)胞的ic50青蒿素對u937細(xì)胞作用的ic50為22.47μmol/l.

2.8硝基藍(lán)四氮唑（nbt）還原試驗(yàn)nbt還原試驗(yàn)結(jié)果不同劑量組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞不一致（表1）.

表1低濃度青蒿素對u937細(xì)胞誘導(dǎo)分化后nbt還原試驗(yàn)陽性率變化（略）

acp0.05vs空白對照，2μmol/l.

3討論

青蒿素是青蒿葉中分離的抗瘧有效成份，具有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯，是我國首先發(fā)現(xiàn)的新構(gòu)型的抗瘧藥，體內(nèi)代謝活性產(chǎn)物為雙氫青蒿素，抗瘧活性高，毒性?。?］.藥動(dòng)學(xué)研究證實(shí)青蒿素類藥物在體內(nèi)吸收快，分布廣，排泄快.毒理學(xué)證實(shí)其毒副作用輕微，毒性主要靶器官為骨髓，可致造血抑制，而這正是治療白血病藥物的特點(diǎn)之一.1991年有學(xué)者首先報(bào)道了青蒿素及其衍生物對肝癌細(xì)胞及人胃癌細(xì)胞有選擇性殺傷活性.此后國內(nèi)外的研究逐漸證實(shí)了青蒿素對結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞同樣具有選擇性抑制及殺滅效應(yīng)，但均缺乏進(jìn)一步的深入研究，包括作用機(jī)制等［9-10］.研究還表明，青蒿素對多種多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞同樣具有顯著的殺滅活性，對mdr1,mrp1和bcrp等耐藥基因高表達(dá)的細(xì)胞系仍具有顯著的活性.初步的作用機(jī)制研究表明，腫瘤細(xì)胞膜是青蒿素作用的靶點(diǎn)之一，青蒿素可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)鈣升高，致其凋亡.同時(shí)，還可通過鐵離子介導(dǎo)的細(xì)胞損傷、細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗血管生成作用等實(shí)現(xiàn)對實(shí)體瘤細(xì)胞的抑制以及殺滅作用［4］.盡管目前青蒿素對于實(shí)體瘤作用效果顯著，但對于血液系統(tǒng)腫瘤包括白血病的研究還比較少見［3］.

本研究的結(jié)果表明，青蒿素在＞6μmol/l的濃度范圍對u937細(xì)胞有著顯著的抑制增殖、促進(jìn)凋亡作用，且與作用時(shí)間和劑量有關(guān)，表現(xiàn)出明顯的劑量時(shí)間依賴效應(yīng).發(fā)現(xiàn)對于正常pbmncs，青蒿素的有效抑制濃度要明顯高于對u937細(xì)胞的抑制濃度，說明其對白血病細(xì)胞具有顯著的選擇性殺傷作用.提示青蒿素可能比多數(shù)經(jīng)典的化療藥物有著更顯著的抗腫瘤活性，其應(yīng)用于臨床治療白血病前景廣闊.惡性腫瘤的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞增殖和分化之間的平衡失調(diào)有關(guān)，表現(xiàn)為增殖失控而分化受阻.許多藥物如維甲酸及某些天然成分可以促進(jìn)白血病細(xì)胞向成熟分化，這也是目前治療白血病的措施之一［11］.可見，許多天然藥