霍華德霉菌直接鏡檢計數(shù)法

霍華德霉菌直接鏡檢計數(shù)法1適用范圍本方法適用于清汁、濁汁、水、濃縮果汁中霍華德霉菌直接鏡檢計數(shù)。2設(shè)備和材料2.1燒杯2.2玻璃棒2.3折光儀2.4顯微鏡2.5郝氏計測玻片3

流程

取樣→稱樣→稀釋→調(diào)節(jié)視野→涂片→觀察→記錄→計算

4步驟

4.1

檢樣制備

取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.344～1.3460（即濃度為7.9～8.8％）。用糖度計或折光儀測定折光指數(shù)或濃度，如果折光指數(shù)過大或過小，須加水或樣品，直至配成標(biāo)準(zhǔn)樣液，才能進行檢驗。

4.2標(biāo)準(zhǔn)視野的調(diào)節(jié)

霍德華霉菌計測用的顯微鏡，要求物鏡放大倍數(shù)為90～125倍，其視野直徑的實際長度為1.382mm，則該視野為標(biāo)準(zhǔn)視野。

檢查標(biāo)準(zhǔn)視野：將載玻片放在載物臺上，配片置于目鏡的光欄孔上，然后觀察。標(biāo)準(zhǔn)視野要具備兩個條件：載玻片上相距1.382mm的兩條平行線與視野相切；配片（測微器）的大方格四邊也與視野相切。如果發(fā)現(xiàn)上述兩個條件，其中有一條不符合，須經(jīng)校正后再使用。

4.3

涂片

4.3.1

檢查玻片

首先用擦鏡紙或綢布沾酒精將載玻片和蓋玻片擦凈。檢查是否擦干凈，可將蓋蓋玻片置于載玻片的兩條突肩上觀察蓋玻片與載玻片突肩的接觸處是否產(chǎn)生牛頓環(huán)，如果沒有產(chǎn)生牛頓環(huán)，表明沒有擦凈，必須重新擦，直至產(chǎn)生牛頓環(huán)，方可使用。

4.3.2

加樣

用滴管或玻棒取一大滴混合均勻的樣液，均勻地攤布于載玻片中央的平坦面上，蓋上蓋玻片（蓋玻片可直接蓋上去，也可以從突肩邊沿處吻合切入）。如果發(fā)現(xiàn)樣液涂布不均勻、有氣泡、或樣液流入溝內(nèi)、從蓋玻片與突肩處流出、蓋玻片與載玻片的突肩處不產(chǎn)生牛頓環(huán)等，應(yīng)棄去不用，重新制作。涂好的制片，在計測室內(nèi)，每個標(biāo)準(zhǔn)視野的樣液體積為：

πr2×0.1＝3.1416×（1.382/2）2×0.1＝0.15mm3

4.4

觀察記錄

4.4.1

觀察視野數(shù)及分布

對一般樣品，每個涂片均檢查50個視野（每一個樣品至少應(yīng)測25個視野，才能代表樣品的各個部分。如果檢查結(jié)果陽性視野低于30％，則檢查25個視野即可；如果在30～40％之間，須檢查50個視野；如果在40～50％之間，須檢查100個視野；如果在50％以上或超過更多，則要繼續(xù)檢查，直至檢查25個視野的結(jié)果與一系列計算結(jié)果無差異為止）。所檢查的50個視野要均勻地分布在計測室上，可用顯微鏡載物臺上帶有標(biāo)尺的推進器來控制，從上到下，或從左到右一行行有規(guī)律地進行觀察。

4.4.2

霉菌菌絲的鑒別

在同一視野內(nèi)霉菌菌絲的特征是：

4.4.2.1

霉菌菌絲一般粗細均勻

4.4.2.2

霉菌菌絲體內(nèi)含有顆粒，具有一定的透明度

4.4.2.3

有的霉菌菌絲有橫隔

4.4.2.4

有的霉菌菌絲有分支

當(dāng)在標(biāo)準(zhǔn)視野下不能確認(rèn)為霉菌菌絲時，可放大200倍或400倍上下調(diào)節(jié)視野，觀察不同平面的菌絲。

4.4.3

記錄結(jié)果

4.4.3.1

陽性視野與陰性視野的判斷：在標(biāo)準(zhǔn)視野下，上下調(diào)節(jié)焦距發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲，其長度超過標(biāo)準(zhǔn)視野直徑（1.382mm）的1/6（即一個小方格的邊長）或三根菌絲總長度超過標(biāo)準(zhǔn)視野直徑的1/6，這個視野稱為陽性視野，否則稱為陰性視野。有時在標(biāo)準(zhǔn)視野中出現(xiàn)極細的菌絲叢或小菌落，則以其直徑來計算，超過視野直徑1/6為陽性視野，否則為陰性視野。陽性視野用“＋”表示；陰性視野用“－”表示之。

4.4.3.2

對初次學(xué)習(xí)霍德華霉菌計測法者，作記錄前，先在記錄紙上劃出計測室上50視野均勻分布的小格，觀察一個標(biāo)準(zhǔn)視野，立即在相應(yīng)的方格內(nèi)作“＋”或“－”的記錄，或“－”以空格表示之。

這種記錄方法，在計測過程中，可減少重復(fù)或遺漏計數(shù)的現(xiàn)象，也可以從記錄表格上“＋”、“－”視野的分布，了解涂片是否均勻。

如果一個樣品做兩個片子，觀察結(jié)果誤差較大（超過6％），則另取樣涂片，觀察測定至誤差＜6％時為止。

5結(jié)果

5.1

計算

霍德華霉菌計測數(shù)值，又稱霉菌數(shù)，用百分比表示。其含義如下：

將0.15mm3標(biāo)準(zhǔn)樣液，均勻地攤布成厚0.1mm，直徑為1.382mm，其面積為1.5mm2的標(biāo)準(zhǔn)視野，在顯微鏡下檢查。按100個視野數(shù)計算，其中發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲存在的視野數(shù)（即陽性視野數(shù)）。

根據(jù)霉菌數(shù)含義，其計算公式如下：

陽性視野數(shù)

霉菌數(shù)（％）＝

×100％

50

舉例：記錄的陽性視野數(shù)，片1為15，片2為16，則樣品的霉菌數(shù)為：

（15＋16）

樣品霉菌數(shù)（％）＝

×1/2×100％＝31％

50

5.2

注意事項

部頒標(biāo)準(zhǔn)為陽性視野不超過40％，在國際貿(mào)易中，合同上無要求時按部頒標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，合同上有要求時按合同執(zhí)行;每抽取一罐樣品制兩個片子，每片觀察50個視野，如果超過標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，應(yīng)該繼續(xù)制片，但片子數(shù)量不得少于