微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法根據(jù)微生物利用碳源特性課件

膜磷脂脂肪酸圖譜分析

(PhospholipidFattyAcidProfile)

代謝指紋技術(shù)(群落水平生理特征圖譜Biolog)Metabolicfingerprintingtechniques-Communitylevelphysiologicalprofiles(CLPPs)微生物群落結(jié)構(gòu)分析膜磷脂脂肪酸圖譜分析微生物群落結(jié)構(gòu)分析膜磷脂脂肪酸分析膜磷脂脂肪酸分析脂肪酸微生物i15:0;a15:0;15:0;a16:0;i17:0;a17:0;17:0G+細菌16:17c/+;cyc17:0;18:17c/+;cyc19:0G-

細菌16:16c甲烷氧化細菌10Me17:0;10Me18:0放線菌18:26,9;18:36,9,12真菌微生物特異磷脂脂肪酸脂肪酸分子通式：X:YωZ（c/t）X：脂肪酸分子的總碳原子數(shù)；Y：烯鍵的數(shù)目；ω：雙鍵的位置（從羧基端起計）;后綴c和t分別表示順式和反式同分異構(gòu)體a(anto):前異構(gòu)甲基支鏈;cyc:環(huán)丙基支鏈;i(iso):異構(gòu)甲基支鏈;Me:甲基支鏈脂肪酸微生物i15:0;a15:0;15:0;a16:在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化應(yīng)用細胞中特異化學(xué)成分的前提該物質(zhì)僅存在于活的生物體中，在死亡微生物體或非生物的有機物質(zhì)中量很小磷脂脂肪酸僅存在于活細胞的細胞膜中，死亡細胞膜磷脂被迅速分解

容易從細胞和土壤中提取出來；有測定該物質(zhì)靈敏、準確的方法PLFAs可從土壤中直接提取出來，并用氣相色譜測定其總量及種類特定微生物具有特異性PLFAs，膜磷脂脂肪酸分析反映微生物群體的多樣性，可以用來測定微生物量中真菌和細菌比例在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化微生物PLFAs組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化在生物體中的濃度恒定：不隨種類、生長條件和生理狀態(tài)而變化應(yīng)用膜磷脂脂肪酸總量與土壤微生物量(SIR法)的相關(guān)性(B??th&Anderson,2003)膜磷脂脂肪酸總量與土壤微生物量(SIR法)的相關(guān)性(B??t真菌膜磷脂脂肪酸特異性土壤中麥角甾醇(真菌組成指示物質(zhì))和18:2w6,9PLFA含量之間的相關(guān)性

(B??th&Anderson,2003)真菌膜磷脂脂肪酸特異性土壤中麥角甾醇(真菌組成指示物質(zhì))和1提取測定土壤脂肪酸基本步驟土壤樣本脂肪提取氯仿:甲醇:緩沖溶液=1:2:0.8(體積比)脂肪組分分離通過硅酸柱將脂肪分為中性脂肪、糖脂和極性的磷脂3個組分根據(jù)脂肪酸的飽和度、羧基數(shù)目及幾何特性等，區(qū)分不同種類的磷脂脂肪酸氣相色譜分析磷脂脂肪酸量提取測定土壤脂肪酸基本步驟土壤樣本脂肪提取氯仿:甲醇:緩沖生物多樣性指標豐度生態(tài)系統(tǒng)中物種總數(shù)；SpeciesEvennessDiversityindex

Shannon指標 Simpson指標 Berger-Parker指標 Alpha指標生物多樣性指標豐度生態(tài)系統(tǒng)中物種總數(shù)；膜磷脂脂肪酸分析應(yīng)用實例-土壤微生物中真菌細菌比例隨土壤pH變化真菌細菌生物量系數(shù)用18:2w6,9PLFA和13種細菌特有的PLFA

分別作為真菌和細菌的指示物

(B??th&Anderson,2003)膜磷脂脂肪酸分析應(yīng)用實例-土壤微生物中真菌細菌比例隨土壤定量描述微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性；敏感地反映微生物群落結(jié)構(gòu)變化較為簡單、有效微生物的PLFAs組成隨環(huán)境及生理狀態(tài)而有所變化大多數(shù)微生物細胞膜上占優(yōu)勢的脂肪酸組成很相似，PLFAs分析不能鑒定微生物種類；是較為粗略的反映微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的參數(shù)，不能指示群落中單個菌種的變化PLFAs方法評價定量描述微生物群落結(jié)構(gòu)和生物多樣性；敏感地反映微生物群落結(jié)構(gòu)

膜磷脂脂肪酸分析

（PhospholipidFattyAcids—PLFAs）

代謝指紋技術(shù)(Biolog)Metabolicfingerprintingtechniques-Communitylevelphysiologicalprofiles(CLPPs）微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法膜磷脂脂肪酸分析微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法根據(jù)微生物利用碳源特性，選擇含有不同碳源物質(zhì)的微平板將土壤懸液接種于GN、GP、Ecoplate微平板中，微平板中氧化還原染料形成的顏色能指示微生物對不同碳源的利用程度Ecoplate平板：96孔微平板中含有3個重復(fù)的31種碳源BIOLOG分析

代謝指紋技術(shù)-群落水平生理特征圖根據(jù)微生物利用碳源特性，選擇含有不同碳源物質(zhì)的微平板BIOL微生物利用不同的碳源物質(zhì)，產(chǎn)生電子傳遞體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；四氮唑接受電子，轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙募踪?音同建）；顏色的深淺及形成速度，反映不同類型微生物的數(shù)量及活性Biolog測定原理微生物利用不同的碳源物質(zhì)，產(chǎn)生電子傳遞體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸A1WaterA2

-Methyl-D-GlucosideA3D-GalactonicAcid

-actoneA4L-ArginineA1WaterA2

-Methyl-D-GlucosideB1PyruvicAcidMethylEsterB2D-XyloseB3D-Galac-turonicAcidB4L-AsparagineB1PyruvicAcidMethylEsterB2D-XyloseC1Tween40C2I-ErythritolC32-HydroxyBenzoicAcidC4L-Phenyl-alanineV1Tween40C2I-ErythritolD1Tween80D2D-MannitolD34-HydroxyBenzoicAcidD4L-SerineD1Tween80D2D-MannitolE1

-Cyclo-dextrinE2N-Acetyl-D-GlucosamineE3

-Hydroxy-butyricAcidE4L-ThreonineE1

-CyclodextrinE2N-Acetyl-D-GlucosamineF1GlycogenF2D-Gluco－saminicAcidF3ItaconicAcidF4Glycyl-L-GlutamicAcidF1GlycogenF2D-GlucosaminicAcidG1D-CellobioseG2Glucose-1-PhosphateG3

-Keto-butyricAcidG4Phenylethyl-amineG1D-CellobioseG2Glucose-1-PhosphateH1D-LactoseH2D,L-

-GlycerolPhosphateH3D-MalicAcidH4PutrescineH1D-LactoseH2D,L-

-GlycerolPhosphateBIOLOG－EcoPlateTMA1A2A3A4A1A2B1B2B3B4B1B2C1C2C3EcoPlate碳源基質(zhì)類型EcoPlate碳源基質(zhì)類型10g土壤＋90ml無菌水4℃振蕩1h（200rpm/min）取上清液用無菌水做成10-3的土壤稀釋液吸取150μl接種至ECO板的微孔中在Emax自動讀盤機上每24h讀取一次590nm處光密度值，直至不再變化。25℃下培養(yǎng)72hBIOLOG測定步驟10g土壤＋90ml無菌水4℃振蕩1h（200rpm采用孔平均染色程度法(AverageWellColorDevelopment,AWCD)或曲線積分法(CI)，得出終點數(shù)據(jù)的標準轉(zhuǎn)換值，AWCD或CI。AWCD=∑(C-R)/n

C：每一個微孔的光密度值

R：空白微孔的光密度值

n

：碳源底物的數(shù)目(ECO板n=31)根據(jù)培養(yǎng)時間計算每一個樣品的總平均AWCD值；應(yīng)用主成分分析(PCA)比較不同的樣本數(shù)據(jù)分析采用孔平均染色程度法(AverageWellColor箭頭所指的是土壤化學(xué)和物理性狀BD:容重;DP:入滲空隙;EC:電導(dǎo)率;AWC:有效水容量;N:氮;OMC:有機質(zhì)含量；SP：飽和率;PW:孔隙水土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)性狀受污水灌溉的影響

△Wastewatertreated

○control箭頭所指的是土壤化學(xué)和物理性狀土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)主成份分析土壤加入不同濃度的Hg培養(yǎng)一周后，在

31種單獨碳源基質(zhì)上最大顯色速率;主成份1和2分別解釋總變異的41.1%和17.4。(Mülleretal.,2001.FEMSMicrobiologyLetters,204,49-53)應(yīng)用實例-微生物群落對土壤中Hg響應(yīng)主成份1主成份2測試板微孔中[Hg(II)](mgml-1) 1 0預(yù)培養(yǎng)時土壤中[Hg(II)](mgg-1)02.51025主成份分析土壤加入不同濃度的Hg培養(yǎng)一周后，在31種單獨優(yōu)點簡單、快速，適用于大量樣品的測定尤其適合對于根際微生物群落結(jié)構(gòu)的分析局限性只適用于可培養(yǎng)的微生物選擇性測定能利用簡單基質(zhì)快速生長的微生物不適于森林土壤常用的Ecoplate平板中碳源物質(zhì)缺乏纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、幾丁質(zhì)等森林土壤中常見的有機物質(zhì)Biolog方法評價優(yōu)點Biolog方法評價mitochondriaAgrobacteriumChlorobiumCytophagaEpulopisciumBacilluschloroplastSynechococcusThermusThermomicrobiumThermotagaAquifexEM17E.coliRiftiaChromatiumHaloferaxMethanospirillumMethanosarciniaMethanobacteriumMethanococcusThermococcusMethanopyrusSulfolobusThermoproteusThermofiliumpSL50pSL4pSL22pSL12Marinegroup1pJP27pJP78originTritichomonasHexamitaGiardiaVairimorphaEncephalitozoonPhysarumTrypanosomaEuglenaNaeglariaEntamoebaDictyosteliumPorphyraParameciumCoprinusHomoZeaBacteria細菌Archaea古細菌Eukarya真核生物大型生物基于16SrDNA分析方法描述群落結(jié)構(gòu)mitochondriaAgrobacteriumChlor基于PCR16SrRNA分析利用熒光染色顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)每克土壤或水體沉積物可含有1010

個細菌而利用瓊脂板分離到的細菌在森林土壤中僅占0.1-1%，在農(nóng)田土壤中也不過10%；利用分子生物學(xué)技術(shù)可以分析包括不可培養(yǎng)的微生物在內(nèi)的整個土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；基于PCR16SrRNA分析利用熒光染色顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)每rDNA擴增及限制性位點分析(ARDRA)

AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis通過PCR擴增、克隆可探測到已知和未知的DNA序列，但每克土中有4000多種微生物，分析每個土壤樣本要測序幾千個序列，非常耗時，利用ARDRA提取土樣中DNA;利用一定的標記引物(如熒光)對樣品中的DNA進行特異擴增；然后進行限制性內(nèi)切酶酶解,獲得末端限制性片段TRFs；電泳分離片段，檢驗TRFs的多樣性；利用主成份分析比較不同樣本的末端限制性片段的特征rDNA擴增及限制性位點分析(ARDRA)Amplifie多聚酶鏈反應(yīng)

-

變性或溫度梯度凝膠電泳技術(shù)

(PCR-DGGE/TGGE)Denaturing/TemperatureGradientGelElectrophoresis

使用1對特異性引物，利用PCR擴增微生物自然群體的16S/18SrRNA基因;產(chǎn)生長度相同但序列不同的DNA片段的混合物，然后用DGGE分離；所得環(huán)境樣本的特異性DGGE條帶，經(jīng)切膠，再進行PCR擴增特異性DNA片段直接測序或經(jīng)DNA克隆、測序；進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建遺傳相似性圖譜，以揭示微生物多樣性演變的內(nèi)在機制多聚酶鏈反應(yīng)-變性或溫度梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGCsCl/ethidiumbromide密度梯度平衡離心法分離同位素標記的DNAa:從利用12C-或13C-methanol作惟一碳源純培養(yǎng)的M.extorquensAM155提取的DNA；b,c:分離前后從加入12C-or13C-methanol作惟一碳源的土壤中提取出的DNABar:1cm(Radajewskietal.,2000Nature403,646-649)穩(wěn)定同位素探針技術(shù)CsCl/ethidiumbromide密度梯度平衡離心從一系列單個基因組序列分析推斷它們在環(huán)境中相互作用Kowalchuk,2005測定特定環(huán)境基因組序列從一系列單個基因組序列分析推斷它們在環(huán)境中相互作用Kowal并利用技術(shù)和試驗設(shè)計降低復(fù)雜程度…并利用技術(shù)和試驗設(shè)計降低復(fù)雜程度…生物多樣性指標Alpha(a)多樣性特定區(qū)域、群落或生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性，一般用物種豐富度表示；Shannon指數(shù)H=-SPilnPi(i=1toS)S:物種數(shù)；Pi=ni/N:第i個物種個體(ni)占全部個體N比例。是communicationentropySimpson指數(shù)D=1-SPi2(i=1toS)

Pi2=

ni(ni-1)/[N(N-1)];0≧D≦1,接近1說明生物多樣性高，或環(huán)境空間異質(zhì)性大，而近于0說明多樣性小

Beta

β-diversityβ=(S1

?

c)+(S2

?

c)S1,S2分別是兩個群落的物種數(shù)；c在兩個群落中都有的物種數(shù)，可用來比較生態(tài)系統(tǒng)或表征環(huán)境梯度的影響；

S?rensen‘ssimilarityindex

b=2c/(S1+S2)

生物多樣性指標Alpha(a)多樣性特定區(qū)域、群落或生參考文獻1)FirestoneM.,BalserT.,HermanD..Definingsoilqualityintermsofmicrobialcommunitystructure.AnnualReportsofResearchProjects,UCBerkeley,19972)GarlandJL.,Mil