穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的斑玉孢遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

穩(wěn)定的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的斑玉孢遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)

蘑菇科，又名玉雞和真菌。在分類上，它屬于擔(dān)子菌、樓層細(xì)菌、傘菌、白蘑菇科和玉雞科。斑玉蕈是一種質(zhì)地脆嫩,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,具有多種保健功效的重要食用菌,同時(shí)也是我國已經(jīng)實(shí)現(xiàn)周年化、工廠化生產(chǎn)的主要食用菌之一。食用菌基因工程研究起步較晚,沒有一個(gè)穩(wěn)定、高效的外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是制約利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行食用菌遺傳改造的主要障礙。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟,科研人員開始致力于食用菌的遺傳轉(zhuǎn)化研究。但傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法[聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)法、電擊法、基因槍法、限制酶介導(dǎo)整合法等]由于操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴和轉(zhuǎn)化效率低等原因,限制了這些方法在食用菌功能基因研究中的應(yīng)用。近年來,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)技術(shù)在雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)、草菇(Volvariellavolvacea)和糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)等食用菌轉(zhuǎn)化中進(jìn)行了一些嘗試,取得了一些成果。另外,ATMT技術(shù)在眾多絲狀真菌中的成功運(yùn)用,也鼓舞人們在斑玉蕈等食用菌的轉(zhuǎn)化研究中對(duì)ATMT技術(shù)開展更多的探索。ATMT技術(shù)作為食用菌分子遺傳學(xué)研究的重要方法和工具之一,在食用菌定向分子育種、基因功能研究以及外源蛋白表達(dá)等方面均具有一定的科研和應(yīng)用價(jià)值。本研究利用含有與斑玉蕈近緣的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)啟動(dòng)子的雙元載體pYN6982(圖1),以潮霉素(Hyg)作為篩選標(biāo)記,增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)基因作為報(bào)告基因,將ATMT技術(shù)成功應(yīng)用于重要的工廠化栽培食用菌斑玉蕈的轉(zhuǎn)化研究中,并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株中EGFP的表達(dá)情況及轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)的整合情況進(jìn)行相關(guān)探究,以期能夠建立穩(wěn)定的斑玉蕈菌絲的ATMT轉(zhuǎn)化方法,獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株,為斑玉蕈基因功能和定向育種研究奠定基礎(chǔ),并為其他食用菌的轉(zhuǎn)化研究提供有益借鑒。1材料和方法1.1材料表面1.1.1食用菌和真菌生物科技中心斑玉蕈SIEF3133雙核菌株由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供;大腸桿菌Top10、農(nóng)桿菌LBA4404菌株購自上海邁其生物科技有限公司;質(zhì)粒載體pYN6982由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。1.1.2dna測序本研究所用的限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司;DNA測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、頭孢噻肟鈉(Cef)、乙酰丁香酮(As)等購自生工生物工程(上海)股份有限公司;潮霉素(Hyg)購自Roche司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.3cch-l1和卡那霉素抗性基因潮霉素抗性基因(Hph-F1:5′-GTCGTGGCGATCCTGCAAGC-3′/Hph-R1:5′-CCTGCGGGTAAATAGCTGCGC-3′)和卡那霉素抗性基因(Kan-F:5′-GGTCATGCATTCTAGGTACT-3′/Kan-R:5′-AATGGCTAAAATGAGAATAT-3′),由上海捷瑞生物工程有限公司合成。1.1.4培養(yǎng)基1.2方法1.2.1含載體pyn292c的農(nóng)桿菌基因型鑒定將雙元載體pYN6982通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株后,用hph基因的上下游引物Hph-F1和Hph-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測,并用酶切作進(jìn)一步確定,經(jīng)鑒定所得到陽性農(nóng)桿菌單菌落即為含載體pYN6982的農(nóng)桿菌菌株。1.2.2斑玉蚤及其子轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化受體的制備:將在固體PDA培養(yǎng)基上活化好的斑玉蕈SIEF3133雙核菌絲帶培養(yǎng)基挑入均質(zhì)儀中,加入100mL液體PDA培養(yǎng)基,高低速交替打碎30s后,液體分裝到3瓶100mL的液體PDA培養(yǎng)基中,靜置避光培養(yǎng)3–5d。將培養(yǎng)好的菌絲再次用均質(zhì)儀打碎,4000×g離心10min,去上清,沉淀用液體共培養(yǎng)基懸浮后待用。斑玉蕈SIEF3133菌株對(duì)潮霉素的敏感性試驗(yàn):斑玉蕈SIEF3133雙核菌株在PDA固體培養(yǎng)基上活化后,用打孔器取直徑約為0.3cm大小的菌塊,分別接種到含不同濃度潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基中央。接種后置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d左右,期間注意觀察菌絲的生長情況,每隔2d用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。同時(shí),將在PDA液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)4d的斑玉蕈SIEF3133用均質(zhì)儀打碎后,吸取100μL菌液涂布于含不同濃度潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基,涂布后置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d左右,期間注意觀察菌絲的萌發(fā)情況。上述兩種處理中,潮霉素的濃度梯度依次都設(shè)置為0、5、10、15、20、30mg/L,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。頭孢噻肟鈉對(duì)斑玉蕈菌絲的毒性試驗(yàn):斑玉蕈SIEF3133雙核菌株在PDA固體培養(yǎng)基上活化后,用打孔器取直徑約為0.3cm大小的菌塊,分別接種到含不同濃度頭孢噻肟鈉的PDA固體培養(yǎng)基中央。頭孢噻肟鈉的濃度梯度依次設(shè)置為0、200、400、600、800mg/L,每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。接種后,置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d,期間注意觀察菌絲的生長情況。每隔2d用十字交叉法測量并記錄斑玉蕈菌落直徑。斑玉蕈轉(zhuǎn)化過程:(1)農(nóng)桿菌LBA4404(含質(zhì)粒pYN6982)在固體LB培養(yǎng)基(含50mg/LRif和50mg/LKan)上劃線培養(yǎng),28°C活化2d;(2)挑取單菌落于6mL左右液體LB培養(yǎng)基(含50mg/LRif和50mg/LKan)中,28°C、150r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.5;(3)3000×g、4°C離心收集菌體,沉淀洗滌后重懸于等體積液體共培養(yǎng)基中,28°C、100r/min振蕩培養(yǎng)4uf02d6h,誘導(dǎo)農(nóng)桿菌毒力的表達(dá);(4)將打碎的斑玉蕈菌絲與農(nóng)桿菌菌液等體積混勻后,涂布于表面鋪有微孔濾膜的共培養(yǎng)基表面,25°C避光共培養(yǎng)2uf02d3d;(5)將共培養(yǎng)基表面的微孔濾膜用鑷子轉(zhuǎn)移到PDA篩選培養(yǎng)基(含Cef400mg/L和Hyg20mg/L)上,25°C避光培養(yǎng)15uf02d20d,篩選轉(zhuǎn)化子;(6)將初篩培養(yǎng)基上能生長的擬轉(zhuǎn)化子在PCR驗(yàn)證后轉(zhuǎn)接到含Cef400mg/L和Hyg30mg/L的PDA抗性培養(yǎng)基上,進(jìn)行復(fù)篩。1.2.3斑玉蚤egfp基因表達(dá)分析轉(zhuǎn)化子的PCR檢測:取生長良好的SIEF3133擬轉(zhuǎn)化子菌絲,置于液氮中研成粉末,用CTAB法提取擬轉(zhuǎn)化子基因組DNA后,取1μL總DNA為模板,用hph基因的上下游引物Hph-F1和Hph-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。轉(zhuǎn)化子的綠色熒光檢測:取在復(fù)篩培養(yǎng)基上生長良好的SIEF3133菌絲,接種到PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d后,在菌落邊緣的培養(yǎng)基中插入無菌蓋玻片,待菌絲爬片后,取蓋玻片在NikoneclipseTE2000-S型熒光顯微鏡下觀察egfp基因表達(dá)情況。轉(zhuǎn)化子的有絲分裂穩(wěn)定性分析:將隨機(jī)挑選的6個(gè)轉(zhuǎn)化子分別接種于無潮霉素選擇壓力的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12d,然后用打孔器在轉(zhuǎn)化子菌落邊緣取直徑約為0.3cm的菌塊轉(zhuǎn)接到新的無選擇壓力的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),上述繼代培養(yǎng)過程共進(jìn)行5次。再次將斑玉蕈轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入含Hyg20mg/L的PDA固體培養(yǎng)基上觀察斑玉蕈生長情況。挑選能夠正常生長的轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA,用hph基因的上下游引物Hph-F1和Hph-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。斑玉蕈轉(zhuǎn)化子中kan基因的PCR檢測:挑選能夠正常生長的轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA,用kan基因的上下游引物Kan-F和Kan-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。1.2.4據(jù)統(tǒng)計(jì)，點(diǎn)玉員工轉(zhuǎn)換子的數(shù)量統(tǒng)計(jì)抗性菌落數(shù)(個(gè)/皿)=各篩選培養(yǎng)平板上抗性菌落總數(shù)/篩選培養(yǎng)平板總數(shù)。2結(jié)果與分析2.1pcr擴(kuò)增hph基因片段將構(gòu)建的表達(dá)載體pYN6982通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株后,隨機(jī)挑取6個(gè)農(nóng)桿菌單菌落通過PCR擴(kuò)增都得到hph基因片段(圖2),證實(shí)pYN6982質(zhì)粒已經(jīng)導(dǎo)入LBA4404中。說明挑取的農(nóng)桿菌可以用于下一步斑玉蕈的轉(zhuǎn)化。2.2斑玉蚤對(duì)潮霉素的抗性斑玉蕈SIEF3133菌株在潮霉素濃度為10mg/L的PDA固體培養(yǎng)基上菌絲有微弱生長,當(dāng)潮霉素濃度到達(dá)20mg/L時(shí),菌絲生長受到強(qiáng)烈抑制,不再生長(圖3),說明斑玉蕈菌株SIEF3133菌絲對(duì)潮霉素十分敏感。同時(shí),打碎菌絲在含有15mg/L潮霉素的PDA固體培養(yǎng)基上,菌絲已經(jīng)不能再生,表明其生長同樣受到潮霉素的強(qiáng)烈抑制。因此確定斑玉蕈SIEF3133的轉(zhuǎn)化子在PDA固體培養(yǎng)基上的最佳潮霉素篩選濃度為20mg/L。2.3頭孢噻鈉對(duì)斑玉蚤生長的影響在轉(zhuǎn)化子的篩選過程中,一定濃度的頭孢噻肟鈉可以抑制農(nóng)桿菌的生長,然而并不清楚在這個(gè)過程中,頭孢噻肟鈉是否會(huì)影響斑玉蕈菌絲的再生。結(jié)果表明,斑玉蕈SIEF3133菌株在頭孢噻肟鈉濃度為200、400、600、800mg/L的固體PDA培養(yǎng)基上均能正常生長,其生長速度和CK沒有顯著性差異(圖4),說明合適濃度的頭孢噻肟鈉對(duì)斑玉蕈的正常生長沒有顯著的毒性。又由于通常農(nóng)桿菌在頭孢噻肟鈉為400mg/L的培養(yǎng)基上已經(jīng)不能生長,由此我們選擇400mg/L的頭孢噻肟鈉作為轉(zhuǎn)基因斑玉蕈篩選時(shí)抑制農(nóng)桿菌生長的合適濃度。2.4pcr檢測hph基因隨機(jī)挑選的8個(gè)擬轉(zhuǎn)化子,提取菌絲基因組DNA,以hph基因上下游引物Hph-F1和Hph-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(圖5)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后,可以看到8個(gè)轉(zhuǎn)化子都明顯出現(xiàn)了hph基因的擴(kuò)增條帶,約為600bp。因此初步判定這8個(gè)轉(zhuǎn)化子呈PCR陽性。2.5復(fù)篩培養(yǎng)基的生長由圖6結(jié)果可知,將初篩培養(yǎng)基上能生長的擬轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后轉(zhuǎn)接到含30mg/L潮霉素的PDA抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)篩時(shí),盡管3個(gè)轉(zhuǎn)化子生長速度有所差異,但都能在復(fù)篩培養(yǎng)基上生長。由此進(jìn)一步確定了轉(zhuǎn)基因斑玉蕈中hph基因已經(jīng)表達(dá),轉(zhuǎn)基因斑玉蕈可以在含較高濃度潮霉素的PDA培養(yǎng)基上生長。2.6egfp基因?qū)τ诎哂裨榈谋磉_(dá),其由圖7結(jié)果可知,雖然有背景熒光存在,挑取的轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌絲能夠在激發(fā)光的激發(fā)下顯示一定程度的綠色熒光信號(hào),而非轉(zhuǎn)化子斑玉蕈則不能夠激發(fā)出綠色熒光。這一結(jié)果表明egfp基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到斑玉蕈細(xì)胞中并且得到了表達(dá)。圖7中轉(zhuǎn)化子熒光信號(hào)的強(qiáng)度相對(duì)較弱,推測可能是由于EGFP蛋白在斑玉蕈中存在翻譯或功能表達(dá)等方面的問題。2.7潮霉素的培養(yǎng)隨機(jī)挑選的6個(gè)轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株在無潮霉素選擇壓力的PDA固體培養(yǎng)基上分別繼代培養(yǎng)5次后,再次轉(zhuǎn)入含有20mg/L潮霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測,6個(gè)轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株都可以擴(kuò)增出hph目的條帶,證明hph基因在轉(zhuǎn)基因斑玉蕈中可以穩(wěn)定遺傳(圖8)。2.8兩組kan基因目的條帶pcr擴(kuò)增由圖9的PCR檢測結(jié)果可知,在隨即挑選的8個(gè)轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株中有2個(gè)的基因組中可以擴(kuò)增增出kan基因目的條帶。但由質(zhì)粒pYN6982的圖譜(圖1)可知,載體上kan基因并不位于T-DNA左右邊界重復(fù)序列之間,因此我們推測在這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株的基因組中可能插入了載體T-DNA邊界重復(fù)序列之外的堿基序列。2.9抗斑玉蚤菌落數(shù)利用1.2.4的統(tǒng)計(jì)方法,統(tǒng)計(jì)5次獨(dú)立試驗(yàn)中的抗性斑玉蕈菌落數(shù),平均轉(zhuǎn)化效率約為6.3個(gè)/皿。其中,單個(gè)培養(yǎng)皿中抗性斑玉蕈菌落數(shù)最高可達(dá)10個(gè)/皿。3egfp基因ATMT技術(shù)不需要傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法中繁瑣的原生質(zhì)體制備過程,轉(zhuǎn)化的受體選擇靈活,菌絲、孢子和菌褶組織的完整細(xì)胞都可以作為轉(zhuǎn)化的受體材料。但不同的轉(zhuǎn)化受體及其預(yù)處理方式的不同,可能直接影響轉(zhuǎn)化效率的高低。本試驗(yàn)采用均質(zhì)儀打碎的斑玉蕈雙核菌絲作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體,成功獲得了轉(zhuǎn)基因斑玉蕈菌株,平均轉(zhuǎn)化效率約為6.3個(gè)/皿。Hatoh等曾報(bào)道利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化斑玉蕈獲得了86個(gè)轉(zhuǎn)化子,但由于試驗(yàn)所用的斑玉蕈菌株、質(zhì)粒載體等的不同,很難將其試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行簡單的比較。但可以肯定的是,由于雙核菌絲經(jīng)打碎后的再生菌絲比較幼嫩,易被農(nóng)桿菌侵染,而且菌絲打碎后的再生能力強(qiáng),且其制備容易,因而是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的合適受體。遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立,目的基因?qū)氩⒉皇寝D(zhuǎn)化的終點(diǎn),更重要的是目的基因要整合到宿主基因組上,并得到正常和穩(wěn)定的表達(dá)。egfp作為一種報(bào)告基因,已經(jīng)在許多領(lǐng)域有所應(yīng)用,如分子標(biāo)記、生物傳感器等。在斑玉蕈中引入該基因能夠?yàn)檠芯炕虻谋磉_(dá)調(diào)控機(jī)制提供重要工具。所獲得的轉(zhuǎn)化子熒光信號(hào)的強(qiáng)度相對(duì)較弱,我們推測可能是由于egfp基因的DNA序列和斑玉蕈的密碼子偏好性不同所致。這提示我們可以參照斑玉蕈的密碼子偏愛性進(jìn)行egfp基因的密碼子優(yōu)化,從而使egfp成為更敏感、高效的斑玉蕈報(bào)告基因。另外,有研究表明內(nèi)含子可能在報(bào)告基因的表達(dá)中起著重要的調(diào)控作用。下一步研究中我們將對(duì)內(nèi)含子的來源及其在報(bào)告基因中的位置進(jìn)行探索,以求建立起以靈敏的egfp作為報(bào)告基因的斑玉蕈報(bào)告系統(tǒng)。盡管在植物和釀酒