動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件

Volume3動物細(xì)胞工程

Volume31

動物細(xì)胞工程是通過對動物細(xì)胞及其組分的分工程序操作，研究生命活動的規(guī)律，實(shí)現(xiàn)對動物的遺傳改造，結(jié)合非生物材料的手段，生產(chǎn)用于治療人類疾病或缺陷的人工器官、組織、細(xì)胞及代謝產(chǎn)物或用于深入研究的材料等為主要研究內(nèi)容的一門學(xué)科。動物細(xì)胞工程是通過對動物細(xì)胞及其組分的分工程序2Chapter1動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

Chapter13本章主要教學(xué)內(nèi)容：動物細(xì)胞培養(yǎng)基本原理體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)本章主要教學(xué)內(nèi)容：4Section1動物細(xì)胞培養(yǎng)基本原理Section15一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的定義動物細(xì)胞培養(yǎng)是指用酶消化法將組織碎塊分離成單個細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下，使細(xì)胞生長繁殖，并保留其一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。

一、動物細(xì)胞培養(yǎng)的定義6體外培養(yǎng)（invitroculture）：就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。分為組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。體外細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞有何差異？體外培養(yǎng)（invitroculture）：7體外培養(yǎng)的與體內(nèi)生長細(xì)胞的差異細(xì)胞離體后，失去了體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡，或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。

如何分化？體外培養(yǎng)的與體內(nèi)生長細(xì)胞的差異8體外培養(yǎng)中細(xì)胞的分化

細(xì)胞是否表現(xiàn)分化，關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。體外培養(yǎng)中細(xì)胞的分化9二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷程1907年，美國生物學(xué)家Harrison將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活數(shù)周，并觀察到細(xì)胞突起的生長過程。1923年，法國學(xué)者卡勒爾設(shè)計卡氏培養(yǎng)瓶培養(yǎng)雞胚的心肌組織成功1951年，厄利爾開發(fā)了供動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷程10動物細(xì)胞基因工程：20世紀(jì)80年代以后，隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)的迅速發(fā)展，已經(jīng)能夠把特定的外源基因通過PCR技術(shù)擴(kuò)增幾千倍，并可轉(zhuǎn)染到動物細(xì)胞內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表達(dá)。近年來，已經(jīng)啟用了300升和1000升的培養(yǎng)罐分別用于生產(chǎn)單克隆抗體和灰色脊髓炎疫苗。此外人體器官的培養(yǎng)為器官移植開辟了一條途徑。動物細(xì)胞基因工程：20世紀(jì)80年代以后，隨著基因工程技術(shù)和細(xì)11二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比，動物細(xì)胞培養(yǎng)有哪些特殊之處？二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)12動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比，主要有以下不同：（1）動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大，無細(xì)胞壁；（2）動物細(xì)胞倍增時間長，生長緩慢，易受污染；（3）培養(yǎng)過程需氧量少，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感；（4）動物細(xì)胞間主要以聚集體形式存在；（5）原代細(xì)胞一般繁殖50代左右即退化死亡。動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比，主要有以下不同：13（6）大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長；（7）動物細(xì)胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需要血清；（8）對于培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性更差，對環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需嚴(yán)格監(jiān)控。（6）大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞只有附著在固體或半固體的表面才能生長14三、體外培養(yǎng)的類型體外培養(yǎng)按過程可分為：原代培養(yǎng)（亦稱初代培養(yǎng)）和傳代培養(yǎng)（亦稱繼代培養(yǎng)）。

原代培養(yǎng)是指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程。實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞（primarycell）。從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。按培養(yǎng)程度：細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)三、體外培養(yǎng)的類型15體外培養(yǎng)種類（培養(yǎng)程度）體外培養(yǎng)16細(xì)胞系是指由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次代培養(yǎng)的細(xì)胞群。大多數(shù)細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下，經(jīng)過有限次的分裂會死亡，例如，人體的成纖維細(xì)胞只可以培養(yǎng)幾個月，傳代50-100次死亡，但偶爾在一定的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)生無休止進(jìn)行繁殖的變異細(xì)胞，形成細(xì)胞系。

細(xì)胞系17細(xì)胞系的特點(diǎn)：（1）可以提供大量的同一類型的細(xì)胞，有利于研究工作；（2）可以大量分離細(xì)胞產(chǎn)物，用于企業(yè)化生產(chǎn)；（3）可以長期凍存于液氮中，需要時可以解凍復(fù)蘇；（4）細(xì)胞系細(xì)胞多數(shù)為非整倍體，個別為二倍體，如WI-38細(xì)胞系的特點(diǎn)：18常用的細(xì)胞系（1）Hela細(xì)胞，1951年取自于HenriettaLacks，她是一名宮頸癌患者，取材8個月后，die，而細(xì)胞則延續(xù)至今。Hela細(xì)胞常用的細(xì)胞系Hela細(xì)胞19（2）CHO細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞ChineseHamsterOvaryCell（2）CHO細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞ChineseHamst20（3）COS-7：SV-40感染的非洲綠猴成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞（3）COS-7：SV-40感染的非洲綠猴成纖維細(xì)胞COS21四、動物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的生長特性－－體外培養(yǎng)細(xì)胞類型四、動物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的生長特性221.粘附型細(xì)胞粘附有兩種含義：（1）細(xì)胞之間相互接觸；（2）細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。動物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞是必須附壁即附著在固體表面生長，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長，這時若取走一片細(xì)胞，存留在表面上的細(xì)胞就會沿著表面生長而重新布滿創(chuàng)面。1.粘附型細(xì)胞23細(xì)胞貼壁延展過程細(xì)胞貼壁延展過程24細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞接觸抑制25粘附型細(xì)胞類型1成纖維型2上皮型3游走型4多形型粘附型細(xì)胞類型1成纖維型26（一）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形狀相似，細(xì)胞大致呈梭形或不規(guī)則形。前者貼壁后呈長梭形，圓形細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)外伸出2－3個長短不同的突起，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。多數(shù)細(xì)胞之間排列疏散，有較大的細(xì)胞間隙，有時也相互平行排列，成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這種形式。人胚肺細(xì)胞在顯微鏡下可觀察到典型的成纖維樣細(xì)胞型。（一）成纖維細(xì)胞型細(xì)胞27成纖維型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞28（二）上皮型細(xì)胞類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞，特點(diǎn)是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細(xì)胞。因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石狀”，局部可以單層的上皮狀“膜片組織”。來源：內(nèi)胚層、外胚層皮膚的表皮細(xì)胞、消化管與呼吸道的上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、消化腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。（二）上皮型細(xì)胞29上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞30（三）游走型細(xì)胞

體外培養(yǎng)的游走型細(xì)胞具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。形態(tài)學(xué)特征：游走型細(xì)胞在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)器皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動，速度快且方向不規(guī)則；細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。

（三）游走型細(xì)胞31該類細(xì)胞不很穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化，當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。表現(xiàn)這種細(xì)胞形態(tài)的主要是具有吞噬作用的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，如顆粒性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。該類細(xì)胞不很穩(wěn)定，外形不規(guī)則且不斷變化，當(dāng)細(xì)胞32游走型細(xì)胞游走型細(xì)胞33（四）多形型細(xì)胞

多形型細(xì)胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，但它不像成纖維細(xì)胞那樣不規(guī)則形態(tài)由寬扁的胞質(zhì)突起所致，而是一般分胞體和胞突兩部分，其中胞突為細(xì)長形，類似絲狀偽足；胞體雖然也略呈現(xiàn)多角形，但沒有成纖維細(xì)胞那樣不規(guī)則。多形型細(xì)胞不常見，只有某些像神經(jīng)組織細(xì)胞等難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的，才可歸于多形細(xì)胞。體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細(xì)胞的細(xì)胞最常見的是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。（四）多形型細(xì)胞34多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞35影響細(xì)胞形態(tài)特征的因素p90血清成分培養(yǎng)基成分及添加成分培養(yǎng)基的酸堿度氣相環(huán)境、溫度等。例如，一些已分化的細(xì)胞在有無血清的培養(yǎng)液中生長，形態(tài)特征就會有所差異Hela細(xì)胞－過酸、過堿時呈梭形

影響細(xì)胞形態(tài)特征的因素p90362.非粘附型細(xì)胞體外生長不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，因此也叫懸浮型細(xì)胞。這類細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：胞體始終為球形一些在體內(nèi)原本就以懸浮狀態(tài)生長的細(xì)胞，當(dāng)接種于體外環(huán)境中也可以以懸浮狀態(tài)生長。包括：血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞，某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等都屬此類細(xì)胞。2.非粘附型細(xì)胞37非粘附型細(xì)胞非粘附型細(xì)胞38懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，細(xì)胞密度一般都較高，培養(yǎng)的效率也高、操作也容易。優(yōu)點(diǎn)：易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制。缺陷：能在懸浮狀態(tài)下生長的細(xì)胞種類有限，不太方便觀察。懸浮培養(yǎng)類似微生物的深層培養(yǎng)。由于是懸浮生長，39Section2體外培養(yǎng)基本技術(shù)Section240一、培養(yǎng)條件1.培養(yǎng)器具培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)管材料：玻璃、塑料（聚苯乙烯、聚丙烯等）、金屬一、培養(yǎng)條件41動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件422.溫度與多數(shù)哺乳類動物體內(nèi)溫度相似，培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度為37℃，偏離此溫度，細(xì)胞的正常生長及代謝將會受到影響甚至導(dǎo)致死亡。3.細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境2.溫度43無菌操作技術(shù)

體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。

無菌操作技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染44消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)Termstoremember:消毒(disinfection)和消毒劑(disinfect45【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會。

【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。

【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】【操作野消毒】46【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

【火焰消毒】在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。

【洗手和著裝】【火焰消毒】47二、培養(yǎng)基（一）細(xì)胞培養(yǎng)基的基本要求：

體外培養(yǎng)的細(xì)胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應(yīng)能滿足細(xì)胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH、無毒、無污染等諸多方面的要求。

細(xì)胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及激素等二、培養(yǎng)基481.水與平衡鹽溶液

（1）培養(yǎng)用水

體外培養(yǎng)的細(xì)胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。配制培養(yǎng)用液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時間一般不應(yīng)超過2周。

（2）緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液

1.水與平衡鹽溶液

（1）培養(yǎng)用水492.滲透壓

細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓，鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

2.滲透壓503.氣體

O2參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細(xì)胞生長、增殖和合成各種成分。一些細(xì)胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細(xì)胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細(xì)胞于95％空氣加5％CO2的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。CO2既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關(guān)系。3.氣體514.pH動物細(xì)胞大多數(shù)pH值約在7.2~7.4(6.8~7.6)在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。

4.pH52（二）天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術(shù)建立早期，體外培養(yǎng)細(xì)胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也是必不可少。（二）天然細(xì)胞培養(yǎng)基

天然培養(yǎng)基是指來自動物體53血清(serum)細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量是關(guān)鍵，而在培養(yǎng)基的主要成份中，動物血清對細(xì)胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應(yīng)用中牛血清是最為廣泛的，血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一，保證血清質(zhì)量也是促進(jìn)生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。

血清(serum)541.血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細(xì)胞的原因：來源充足、制備技術(shù)成熟、經(jīng)過長時間的應(yīng)用考驗(yàn)人們對其有比較深入的理解。牛血清分為：

小牛血清、新牛血清、胎牛血清。

1.血清種類:552.血清的主要成分

血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復(fù)雜的混合物，其組成成份（血清的成份可能有幾百種之多）雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細(xì)胞生長或抑制生長活性是達(dá)到生理平衡的。

2.血清的主要成分563.血清主要作用：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)氨基酸、維生素、無機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細(xì)胞生長必須的物質(zhì)。提供激素和各種生長因子激素：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子：成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。

3.血清主要作用：57提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起重要作用。提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷。對培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用：有一些細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓樣細(xì)胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。

提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質(zhì)584.細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)對大多數(shù)細(xì)胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學(xué)液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能促進(jìn)某些細(xì)胞的生長（成纖維細(xì)胞），同時抑制另一類細(xì)胞生長（表皮細(xì)胞）。血清含一些對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細(xì)胞的多胺反應(yīng)（如精胺、亞精胺）形成有細(xì)胞毒性作用的聚精胺。4.細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)59動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。取材中可能帶入支原體、病毒，對細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不可靠性。血清的使用使得實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中的分離純化工作很難完成。價格昂貴，是構(gòu)成動物細(xì)胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不605.血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：取材對象取材過程血清必須嚴(yán)格執(zhí)行相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)

5.血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)61血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等微生物檢測：包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測促生長效果：這是血清重要的特性之一，應(yīng)當(dāng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測。好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。

血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面626.血清的使用與儲存正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應(yīng)有的作用。

（1）使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃，30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。6.血清的使用與儲存63（2）儲存條件血清一般儲存于－20℃，同時應(yīng)避免反復(fù)凍融。購買血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前置于4℃融化。

（3）使用濃度使用濃度一般為5－20％（合成培養(yǎng)基），最常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生變化。（2）儲存條件64合成細(xì)胞培養(yǎng)基（三）合成細(xì)胞培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計、配制的培養(yǎng)基。1.基本培養(yǎng)基包括：無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物、水。

合成細(xì)胞培養(yǎng)基（三）合成細(xì)胞培養(yǎng)基65（1）無機(jī)鹽細(xì)胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4，對調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性以及溶液的酸堿度都是必須的。（1）無機(jī)鹽66（2）氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸(L型)。此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重要作用：細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。

（2）氨基酸67（3）碳水化合物是細(xì)胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。

培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。

（3）碳水化合物68（4）維生素主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。

（4）維生素692.促生長因子及激素

已證實(shí)，各種激素、生長因子對于維持細(xì)胞的功能、保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細(xì)胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長作用等。

2.促生長因子及激素703.其他成分酚紅：一種pH指示劑，當(dāng)溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時pH大于8.4呈紅色(紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8)。在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)，以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A(HS-CoA)

3.其他成分71（四）無血清技術(shù)及無血清培養(yǎng)基

經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。

無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。

（四）無血清技術(shù)及無血清培養(yǎng)基72無血清培養(yǎng)基的基本配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：促貼壁物質(zhì)：一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等促生長因子及激素：胰島素、生長激素酶抑制劑：須含胰酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白等微量元素：硒無血清培養(yǎng)基的基本配方：73使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)增加確定性性能更加一致容易進(jìn)行純化和下游加工細(xì)胞功能的精確評估增強(qiáng)生長和增加產(chǎn)量生理反應(yīng)性的較好對照增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)74（五）其它動物細(xì)胞培養(yǎng)必需的溶液1.平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）組成：主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成作用：維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。用途：主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。D-Hank‘s與Hank’s：主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。兩者緩沖能力較弱Earle平衡液：含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，緩沖能力較強(qiáng)。（五）其它動物細(xì)胞培養(yǎng)必需的溶液752.培養(yǎng)基pH調(diào)整液合成培養(yǎng)液大多呈微酸性NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)。

HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。

2.培養(yǎng)基pH調(diào)整液763.消化液（1）胰蛋白酶溶液組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因?yàn)檫@些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。（2）乙二胺四乙酸二鈉（Na2－EDTA）作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接（非酶性解離）。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。（3）膠原酶溶液膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用3.消化液774.抗生素溶液：（1）青鏈霉素：俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌（細(xì)胞壁）有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌（蛋白質(zhì)）有效。青霉素：100U/ml，鏈霉素：100μg/ml

（2）卡那霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，50μg/ml（3）制霉菌素干擾細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的生成，25U/ml4.抗生素溶液：785.谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。

5.谷氨酰胺補(bǔ)充液79三、基本方法和傳統(tǒng)技術(shù)（一）細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程1.準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無法進(jìn)行。三、基本方法和傳統(tǒng)技術(shù)802.取材

在無菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。2.取材813.接種將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中即進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)。組織塊：直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。細(xì)胞：一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。3.接種824.培養(yǎng)原代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常；有無污染；培養(yǎng)基的pH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示）；培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。4.培養(yǎng)835.凍存及復(fù)蘇—低溫生物學(xué)在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時再復(fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。凍存：

溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。5.凍存及復(fù)蘇—低溫生物學(xué)84復(fù)蘇：一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)?？傇瓌t：慢凍快溶復(fù)蘇：總原則：慢凍快溶85（二）細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法p961.懸滴培養(yǎng)法是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)，是組織、器官培養(yǎng)的經(jīng)典方法，最早是由Harrison于1907年創(chuàng)立的。基本要點(diǎn)是：將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛在蓋玻片下，再置放于一凹形載片之上，最后用熔蠟密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（二）細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法p9686A可用于雙蓋片培養(yǎng)的凹載片。B可用于單蓋片培養(yǎng)的凹載片。C適用于在顯微鏡下直接觀察的凹載片。D凹載片的側(cè)面觀。用于懸滴培養(yǎng)的凹載片A可用于雙蓋片培養(yǎng)的凹載片。用于懸滴培養(yǎng)的凹載片87方法：A-D在蓋玻片上滴加胚胎提取液、血漿、和植塊，混勻。培養(yǎng)基凝固后將植塊包埋。E在凹載片周圍涂凡士林。F將凹載片向下壓向蓋玻片。G將F反轉(zhuǎn)，蓋玻片周圍涂熔蠟。H放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。方法：882.旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法方法：將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，在將其固定在一可以旋轉(zhuǎn)的裝置上，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的一種方法。特點(diǎn)：培養(yǎng)物可交替接觸培養(yǎng)液與氣體環(huán)境，有利于細(xì)胞或組織的生長。2.旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法89動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件903.灌注小室培養(yǎng)法方法：將細(xì)胞接種于一個由上下兩個蓋玻片（分別構(gòu)成上壁與下壁）與一金屬圈（構(gòu)成側(cè)壁）密封圍成的小室內(nèi)，保持在一定條件下培養(yǎng)。在小室的側(cè)面分別有液體流入和流出的開口，供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出。1912年，由Burrows嘗試設(shè)計。特點(diǎn)：細(xì)胞生長較少受到代謝產(chǎn)物的影響3.灌注小室培養(yǎng)法91A-排液瓶B-受液瓶C-不銹鋼灌注小室D-小孔道E與F、J-2號注射針頭G與H-塑料導(dǎo)管I-玻璃導(dǎo)管K與L-14號注射針頭A-排液瓶B-受液瓶C-不銹鋼灌注小室D-小孔924.培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法將擬培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，再放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)瓶材料：早期－玻璃培養(yǎng)瓶目前－一次性塑料培養(yǎng)瓶形狀：扁平4.培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法935.蓋玻片培養(yǎng)以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)的組織、細(xì)胞接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)：方便觀察、染色便于長期保存增加培養(yǎng)面積5.蓋玻片培養(yǎng)94A內(nèi)放3張載玻片的試管B玻璃試管C帶狹頸的旋轉(zhuǎn)管A內(nèi)放3張載玻片的試管956.培養(yǎng)板培養(yǎng)法具體做法是將培養(yǎng)細(xì)胞接種在培養(yǎng)板的孔內(nèi)，然后在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最常用的培養(yǎng)板有6孔、24孔和96孔培養(yǎng)板，后者最為常用。一般都是一次性使用。6.培養(yǎng)板培養(yǎng)法96（三）體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程三個主要階段1.原代（初代）培養(yǎng)期是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)這個階段，一般持續(xù)1-4周。在這個階段，細(xì)胞比較活躍，有細(xì)胞分裂，但不旺盛。（三）體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程97原代培養(yǎng)包括以下幾個方面的含義：培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；原代培養(yǎng)中的“代”并非細(xì)胞的“代”數(shù)，因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞；原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。原代培養(yǎng)包括以下幾個方面的含義：98動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件99動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)課件100機(jī)械分散組織細(xì)胞方法機(jī)械分散組織細(xì)胞方法101消化初代培養(yǎng)法基本步驟（組織塊培養(yǎng)、組織消化培養(yǎng)p99）消化初代培養(yǎng)法基本步驟102原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是否成功主要與以下五種因素有關(guān)：供體年齡供體生理狀態(tài)組織污染與否培養(yǎng)技術(shù)和方法適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素

原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是1032.傳代期當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。一般情況下，當(dāng)傳代10-50次后，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以致完全停止。2.傳代期104一般傳代培養(yǎng)的步驟：(1)吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；(2)加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底；(3)2～5分鐘后檢查，如有細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，終止消化；(4)吸出消化液，加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動以免細(xì)胞流失，洗去殘留的消化液。如果單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液；(5)用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計數(shù)后記錄其濃度；(6)重新接種培養(yǎng)一般傳代培養(yǎng)的步驟：105消化法傳代培養(yǎng)步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟106細(xì)胞培養(yǎng)過程生長曲線細(xì)胞培養(yǎng)過程生長曲線1073.衰退期該階段細(xì)胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開始衰退凋亡。如成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡，來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān))；來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡，來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

3.衰退期108細(xì)胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)：合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)細(xì)胞核、線粒體、膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)細(xì)胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括：109細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，110細(xì)胞計數(shù)：1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

細(xì)胞計數(shù)：111培養(yǎng)細(xì)胞的污染問題及檢測

細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒。無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等是主要的污染源。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

培養(yǎng)細(xì)胞的污染問題及檢測細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)112細(xì)胞污染的種類和判定

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：1)培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。4)細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。細(xì)胞污染的種類和判定細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、113污染物的檢測

1.細(xì)菌和真菌污染的檢測肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察