白頭翁湯對炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織nlrp3、asc、caspase-1、il-1表達(dá)的影響

白頭翁湯對炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織nlrp3、asc、caspase-1、il-1表達(dá)的影響

炎癥性腸?。╥bd）是一種以免疫失衡為特征的腸疾病，主要包括潰瘍性胃炎和克羅恩病。IBD的發(fā)病機(jī)制未明,一般認(rèn)為是結(jié)腸微生物菌群的紊亂與結(jié)腸黏膜過度的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腸道上皮組織損傷引起的炎癥性疾病。NLRP3炎癥小體是一種蛋白復(fù)合體,屬于核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體(nucleotide-bindingoligomerizationdomainlikereceptor,NLR)家族的成員,插頭域(pyrindomain)含有3個(gè)蛋白,研究認(rèn)為NLRP3炎癥小體在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。白頭翁湯出自張仲景《傷寒論》,由白頭翁、黃連、黃柏和秦皮四味中藥組成。方用苦寒而入血分的白頭翁為君,清熱解毒、涼血止痢;黃連、黃柏為臣,清熱燥濕、瀉火解毒;秦皮為佐,清熱解毒、收澀治痢。四味合用,加強(qiáng)清熱止痢之功,為治療毒熱血痢之名方,在古代和現(xiàn)代臨床上的應(yīng)用非常廣泛,用以治療IBD、直腸炎等均收到良好的效果?，F(xiàn)代藥理研究表明白頭翁湯具有抑菌、抗炎、抗痙攣以及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的作用,但其治療炎癥性疾病的分子機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)旨在探討白頭翁湯對2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)所致IBD模型小鼠NLRP3炎癥小體的影響,探討白頭翁湯的作用機(jī)制。1材料和機(jī)器1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級BALB/c小鼠,體質(zhì)量20～25g,購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,合格證號:0092230g,適應(yīng)新環(huán)境1w后用于實(shí)驗(yàn)。1.2陽性對照藥,以sis、秦皮、tnbs、sap為原料白頭翁(RadixPulsatillae)、黃連(RhizomaCoptidis)、黃柏(CortexPhellodendriChinensis)、秦皮(CortexFraxini)均由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部提供,經(jīng)鄺翠儀主任藥師鑒定為正品;陽性對照藥柳氮磺胺嘧啶腸溶片(SASP),購自上海信誼嘉華藥業(yè);zVAD-fmk、TNBS,Sigma公司;RTreagentkit、SYBRpremixExTaqⅡ,takara公司;IL-1βElisa試劑盒、IL-18Elisa試劑盒,上海豐翱生物公司;Caspase-1免疫組化試劑盒,武漢博士德生物公司。2方法2.1實(shí)驗(yàn)藥物的制備2.1.1藥渣濃縮或添加雙蒸法白頭翁15g、黃連6g、黃柏12g、秦皮12g,以上四味置于蒸餾燒瓶中,加8倍量雙蒸水浸泡2h,加熱回流1h,趁熱用紗布過濾。藥渣再分別加8倍量水和6倍量水加熱回流1h。合并3次濾液。分別減壓濃縮為195、390、780g/L(生藥)制成低、中和高劑量。原液裝瓶,高壓消毒后密封保存。2.1.2適用于柳氮磺酰胺吡啶的稀疏劑SASP碾成粉,用雙蒸水配成濃度為30g/L的混懸液。2.1.3zvad-fmk西格瑪稀土生產(chǎn)用生理鹽水將zVAD-fmk配成0.5mg/mL的稀釋液。2.1.4用于制備模型試劑tnbs的溶液將5%TNBS(Sigma公司)和無水乙醇按照1∶1的比例配成2.5mgTNBS/50%乙醇溶液。2.2藥動過速及給藥劑量84只小鼠隨機(jī)分為7組(n=12):乙醇對照組、模型組、SASP組、zVAD組及白頭翁湯低、中、高劑量組。采用Morris等報(bào)道的TNBS法造模。小鼠禁食24h后,5%的水合氯醛腹腔注射輕度麻醉,外徑1.8mm橡膠管(小號導(dǎo)尿管)插入結(jié)腸,至距肛門約3.5cm處,將TNBS溶液按100mg/kg注入結(jié)腸,注入后停留20s,緩緩拔出導(dǎo)尿管。夾閉肛門,置于37℃電熱毯上頭低位30min后放入籠中,待其自然蘇醒。乙醇對照組給予100mg/kg的無水乙醇灌腸。常規(guī)飼養(yǎng)。造模后24h開始給藥,乙醇對照組和模型組分別給予生理鹽水0.5mL灌胃,同時(shí)腹腔注射0.1mL生理鹽水;SASP組給予SASP混懸液0.5mL灌胃,同時(shí)腹腔注射0.1mL生理鹽水;低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)濃度的白頭翁湯0.5mL灌胃,同時(shí)腹腔注射0.1mL生理鹽水;zVAD-fmk組給予中劑量白頭翁湯0.5mL灌胃,同時(shí)腹腔注射0.1mLzVAD-fmk稀釋液。給藥1次/d,共7d,第8天處死動物,剖腹,摘取距肛門4cm及以上結(jié)腸4cm～5cm,沿腸系膜縱軸剖開,將結(jié)腸組織分成3段:一段用PCR樣品保存液保存,用于RT-PCR的檢測;一段用4%甲醛固定,用于HE染色及免疫組化檢測;一段用PBS液保存,用于Elisa檢測。2.3疾病癥狀評價(jià)用大便性狀和便血程度作疾病活動指數(shù)(diseaseactivityindex,DAI)評價(jià)小鼠的疾病癥狀;采用涵蓋結(jié)腸炎癥浸潤的程度、水腫、充血、壞死及炎癥的深度的Wallace黏膜損害評分和結(jié)腸組織HE染色來評價(jià)小鼠結(jié)腸黏膜損害程度。2.4r-pcr檢測2.4.1rna的檢測從PCR樣品保存液取100mg組織,TRIzol裂解待測組織,氯仿抽提,異丙醇沉淀,75%乙醇洗滌,DEPC水溶解,使用分光光度計(jì)檢測在D(λ)260/280處檢測總RNA濃度。2.4.2合成pta的內(nèi)容嚴(yán)格按照takara試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。2.4.3pcr擴(kuò)增嚴(yán)格按照takara試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列和反應(yīng)條件見表1。2.5elisa測試稱取組織質(zhì)量,冰上勻漿,離心后收集上清,嚴(yán)格按照Elisa試劑盒進(jìn)行,以空白調(diào)零,450nm波長依次檢測各孔光密度D(λ)值。2.6微波修復(fù)dab組織固定,常規(guī)脫水,冰凍切片;烤片,脫蠟,水化;3%H2O2封閉,EDTA(1∶50)微波修復(fù);PBST洗滌,畫圈,滴加一抗,4℃冰箱過夜;PBST洗滌,滴加二抗,37℃孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;拍照;利用Image-ProPlus6.0測定積分光密度值(IOD)值。2.7統(tǒng)計(jì)處理各組結(jié)果用ˉx±s表示,數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,多組分析采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1小鼠體質(zhì)量恢復(fù)TNBS造模24h后各組小鼠開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降,活動度明顯下降,進(jìn)食減少,毛發(fā)無光澤。2d后開始出現(xiàn)不同程度的腹瀉、便血,肛門周圍出現(xiàn)不同程度的大便結(jié)痂,并污染肛門周圍皮毛。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,與實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量比較,乙醇對照組和SASP組小鼠體質(zhì)量恢復(fù)并增加,其余各組小鼠體質(zhì)量降低程度由高到低為:zVAD組、模型組、白頭翁湯低劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯高劑量組。其中,模型組小鼠體質(zhì)量低于乙醇對照組(P<0.01);SASP組及白頭翁湯中、高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.01);白頭翁湯低劑量小鼠體質(zhì)量低于SASP組(P<0.01);zVAD組小鼠體質(zhì)量低于白頭翁湯中劑量組(P<0.01),與模型組相當(dāng)(P>0.05)。見表2。3.2小鼠培養(yǎng)條件對dai評分和黏膜鏡下評分的影響TNBS造模24h后各組小鼠開始出現(xiàn)不同程度的軟便和隱血實(shí)驗(yàn)陽性,3d后開始出現(xiàn)不同程度的血便。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,乙醇對照組DAI評分為0,其余各組DAI數(shù)值由高到低依為模型組、zVAD組、白頭翁湯低劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯高劑量組、SASP組。其中模型組DAI評分高于乙醇對照組(P<0.01);SASP組及白頭翁湯中、高劑量組DAI評分低于模型組(P<0.01);白頭翁湯低、中劑量組DAI評分高于SASP組。見表3。小鼠Wallace評分結(jié)腸黏膜損害評分和黏膜鏡下評分由高到低依次為:模型組、白頭翁湯低劑量組、zVAD組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯高劑量組、SASP組。其中模型組黏膜損害評分高于乙醇對照組(P<0.01);SASP組及白頭翁湯中、高劑量組黏膜損害評分低于模型組(P<0.01);白頭翁湯低劑量組黏膜損害評分高于SASP組;zVAD組黏膜損害評分高于白頭翁湯中劑量組(P<0.05),與模型組相當(dāng)(P>0.05)。模型黏膜鏡下評分高于乙醇對照組(P<0.01);SASP組、中劑量組和高劑量組黏膜鏡下評分低于模型組(P<0.01);白頭翁湯低劑量組黏膜鏡下評分高于SASP組;zVAD組黏膜鏡下評分與白頭翁湯中劑量組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖1。3.3不同劑量白頭翁湯組織的組織病理學(xué)檢測乙醇對照組:黏膜上皮完整、充血不可見,腺體排列規(guī)則,可見少量炎性細(xì)胞浸潤。模型組:黏膜上皮基本潰爛,黏膜腺體破壞嚴(yán)重,可見大量炎性細(xì)胞浸潤。SASP組:黏膜上皮基本完整、充血不明顯,腺體排列較規(guī)則,可見少量炎性細(xì)胞浸潤。低劑量組:黏膜上皮缺損、充血明顯,腺體排列不規(guī)則,可見較多炎性細(xì)胞浸潤。白頭翁湯中劑量組:黏膜上皮基本完整、充血不明顯,腺體排列欠規(guī)則,可見較多炎性細(xì)胞浸潤。白頭翁湯高劑量組:黏膜上皮基本完整、充血不明顯,腺體排列較規(guī)則,可見少量炎性細(xì)胞浸潤。zVAD組:黏膜上皮缺損嚴(yán)重、充血明顯,腺體排列不規(guī)則,可見較多炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。3.4各組caspase-1、白頭翁湯mrna表達(dá)量的比較NLRP3mRNA表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯低劑量組、模型組、zVAD組、SASP組、乙醇對照組;ASCmRNA表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、zVAD組、模型組、SASP組、白頭翁湯低劑量組、乙醇對照組;Caspase-1mRNA表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、模型組、白頭翁湯低劑量組、SASP組、zVAD組、乙醇對照組。其中乙醇對照組NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表達(dá)量低于模型組(P<0.01);SASP組NLRP3mRNA表達(dá)量低于模型組(P<0.05),Caspase-1mRNA表達(dá)量低于模型組(P<0.01);白頭翁湯中劑量組和高劑量組NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表達(dá)量高于模型組(P<0.01);白頭翁湯中劑量組和高劑量組NLRP3,ASC,Caspase-1及白頭翁湯低劑量組的NLRP3的mRNA表達(dá)量高于SASP組(P<0.01);zVAD組NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA表達(dá)量低于白頭翁湯中劑量組(P<0.01)。見圖3。3.5白頭翁湯低劑量、模型、zvad的各組小鼠血清中隨機(jī)應(yīng)變量的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-18表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯低劑量組、SASP組、模型組、zVAD組、乙醇對照組;IL-1β表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯低劑量組、SASP組、模型組、乙醇對照組、zVAD組。其中模型組IL-18,IL-1β的表達(dá)量高于乙醇對照組(P<0.01);白頭翁湯中劑量組IL-18和IL-1β的表達(dá)量高于模型組(P<0.05),白頭翁湯高劑量組IL-18和IL-1β的表達(dá)量高于模型組(P<0.01);SASP組IL-1β的表達(dá)量低于模型組(P<0.01);白頭翁湯低劑量組和白頭翁湯中劑量組IL-1β的表達(dá)量高于SASP組(P<0.01),白頭翁湯高劑量組IL-18和IL-1β的表達(dá)量高于SASP組(P<0.01);zVAD組IL-18的表達(dá)量低于中劑量組(P<0.05),IL-1β的表達(dá)量低于白頭翁湯中劑量組(P<0.01)。見圖4。3.6模型組與白頭翁湯中的uid表達(dá)量Caspase-1蛋白在結(jié)腸上皮細(xì)胞,黏膜下層,肌層和漿膜均有表達(dá),顯棕黃色。乙醇對照組可見少量棕黃色染色,其余各組可見不同程度的大量棕黃色(圖5)。Caspase-1IOD值表達(dá)量由高到低依次為:白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯中劑量組、白頭翁湯低劑量組、模型組、SASP組、zVAD組、乙醇對照組。其中模型組IOD值高于乙醇對照組(P<0.01);SASP組IOD值低于模型組(P<0.01),白頭翁湯中劑量組IOD值高于模型組(P<0.05),白頭翁湯高劑量組IOD值高于模型組(P<0.01);白頭翁湯低劑量組、白頭翁湯中劑量組和白頭翁湯高劑量組IOD值高于SASP組(P<0.01);zVAD組IOD值低于中劑量組(P<0.05)。見圖6。4白頭翁湯治療u2005的作用機(jī)制探討IBD通常反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,臨床表現(xiàn)主要有腹瀉、腹痛和黏液膿血便。除了治療炎癥性腸病的傳統(tǒng)三大類藥物(氨基水楊酸類藥物、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑)外,生物制劑、微生態(tài)制劑等為炎癥性腸病的臨床治療提供了更多的選擇和嘗試。長期以來中醫(yī)藥在該病的治療上自成體系,以其療效良好、復(fù)發(fā)率低、毒副作用小等特點(diǎn)逐漸在炎癥性腸病的臨床治療上占據(jù)重要地位。最近研究認(rèn)為,NLRP3的表達(dá)量減少與克羅恩病的發(fā)生相關(guān)。Zaki等通過對DSS誘導(dǎo)的NLRP3ue078,ASCue078和Caspase-1ue078小鼠結(jié)腸炎模型的研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體具有抵御DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用,證實(shí)NLRP3發(fā)揮作用主要是通過在非造血肝細(xì)胞中的表達(dá),NLRP3炎癥小體激活后主要是通過增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞增生來發(fā)揮對腸道的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過白頭翁湯治療IBD模型小鼠發(fā)現(xiàn),SASP和