炎癥性腸病動(dòng)物模型研究進(jìn)展

炎癥性腸病動(dòng)物模型研究進(jìn)展

炎癥性腸?。╥bd）包括潰瘍性胃炎（tc）和克羅恩?。╟d），其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前，關(guān)于abd研究所取得的成果大多來(lái)自動(dòng)物模型的研究，因此建立合適的動(dòng)物模型非常重要。本文從IBD常用動(dòng)物模型的主要機(jī)理,制備方法以及模型用途等方面作一綜述。1動(dòng)物的一般情況下局部的不良反應(yīng)乙酸能增加血管通透性,激活激肽,促進(jìn)纖維蛋白水解,干擾凝血機(jī)制過(guò)程,該模型主要是利用乙酸的這種毒性作用直接破壞結(jié)腸上皮,腸內(nèi)細(xì)菌和毒素侵入腸壁,引起急性炎癥反應(yīng),包括出血、水腫和典型的潰瘍。動(dòng)物可采用大鼠、小鼠、家兔和豚鼠等。造模方法:目前較為常用的是經(jīng)腸腔灌注:大鼠禁食24h后麻醉,將聚乙烯導(dǎo)管自肛門插入8cm,然后注入4%~10%的乙酸1~2ml,使動(dòng)物保持頭向下的體位10~30s,然后用生理鹽水沖洗3次。造模后動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉、大便隱血陽(yáng)性及血便,3d后達(dá)到高峰,結(jié)腸組織檢查可見(jiàn)早期黏膜及黏膜下層水腫,隱窩膿腫,上皮固有層中彌散性中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜潰瘍及部分或完全脫落,點(diǎn)狀或片狀出血,類似人類UC的急性期改變。上述病理改變一般在1~2w后自愈。模型制作成功的關(guān)鍵是乙酸的濃度和作用時(shí)間,它直接影響病變的嚴(yán)重程度。本模型制作方法簡(jiǎn)單,成本低,周期短,成功率高,重復(fù)性好,結(jié)腸產(chǎn)生的炎癥及細(xì)胞因子的變化與人類UC相似,是目前實(shí)驗(yàn)性UC模型中應(yīng)用最廣泛的模型之一,主要用于UC急性炎癥發(fā)作期藥物治療的療效觀察和評(píng)價(jià)黏膜愈合機(jī)制。缺點(diǎn)是其對(duì)結(jié)腸黏膜及血管造成化學(xué)性灼傷,與IBD致病因素差別較大,不能確切反映人類IBD免疫學(xué)機(jī)制和遺傳學(xué)機(jī)制,亦不能反映IBD慢性、復(fù)發(fā)的特點(diǎn),且自愈性強(qiáng),不適合藥物長(zhǎng)期療效觀察。2tnbs造模方法TNBS多與乙醇合用進(jìn)行造模。該模型的機(jī)制是乙醇破壞腸黏膜屏障,TNBS作為一種有機(jī)酸半抗原滲入結(jié)腸組織,與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合,形成全抗原,使T淋巴細(xì)胞致敏,溶解了與半抗原結(jié)合的動(dòng)物自身細(xì)胞,引起腸壁一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),隨著組織的逐漸修復(fù),可出現(xiàn)一系列腸壁的增生性改變。造模方法:通常參考Morris方法,將大鼠禁食24小時(shí)后麻醉,用長(zhǎng)約15cm,直徑2mm的硅膠管(或聚乙烯導(dǎo)管)由肛門輕緩插入8cm處的腸腔內(nèi),快速(5s內(nèi))注入50~150mg/kg的30%~50%TNBS乙醇溶液。造模1d后出現(xiàn)豎毛、懶動(dòng)、厭食、大便次數(shù)增多,稀便,夾雜黏液或膿點(diǎn)等癥狀,3d后達(dá)到高峰;1w后大鼠出現(xiàn)大便隱血陽(yáng)性及便血,肉眼可見(jiàn)組織黏膜水腫;2w后組織黏膜出現(xiàn)壞死潰瘍,隨后出現(xiàn)組織增生,腸壁增厚,腸腔變小,病變可持續(xù)8w左右,呈現(xiàn)慢性的炎癥變化。該模型中TNBS的用量及濃度決定模型病變的輕重,一般以100mg/kg為造模的最佳劑量。目前亦有用二硝基苯磺酸(DNBS)造模的,其機(jī)制、造模方法、癥狀、癥狀高峰期出現(xiàn)時(shí)間、各個(gè)時(shí)間段的組織病理學(xué)變化與TNBS結(jié)腸炎相似,但DNBS毒性較小,價(jià)格相對(duì)也較低。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)該造模方法在不同種屬動(dòng)物身上會(huì)誘導(dǎo)出不同的結(jié)腸炎模型,SJL/J小鼠是該模型的易感動(dòng)物,誘導(dǎo)的模型為Th1型,即類似于人類的CD,Balb/C小鼠誘導(dǎo)出的模型則是Th1和Th2混合型。國(guó)內(nèi)報(bào)道該模型大鼠的病理特點(diǎn)是組織逐漸呈一種慢性炎癥變化,病程較長(zhǎng),各種炎癥介質(zhì)如PGF2、TXB2、LTB4、6-keto-PGE1α、LTC4、PAF和IL等也發(fā)生明顯變化,且有類似人類UC的大體病理及組織學(xué)改變,與人類UC相似。亦有學(xué)者認(rèn)為該模型類似于人類CD,如龍友明等用TNBS建立大鼠模型,于第2周后見(jiàn)鋪路石樣征,甚至節(jié)段性炎癥,認(rèn)為該造模方法與人類CD相近。目前對(duì)該模型所屬疾病報(bào)道不一。TNBS造模法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、重現(xiàn)性好、造模時(shí)間短、病變持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程,是一種經(jīng)典的動(dòng)物模型,適合于對(duì)防治藥物的篩選及其作用機(jī)制的研究。缺點(diǎn)是缺乏特征性急性期表現(xiàn),且動(dòng)物死亡率高。3急、慢性小鼠結(jié)腸模型DSS是人工合成的肝素類多糖。DSS模型的機(jī)制尚未闡明,可能與DSS影響DNA合成、抑制上皮細(xì)胞增生、破壞腸黏膜屏障、巨噬細(xì)胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)有關(guān)。腸道菌群可能與小鼠急性期炎癥有關(guān),而T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂可能與慢性期腸道病損有關(guān)。本模型適用于多種動(dòng)物,包括各種大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠以及豚鼠等,其中大鼠和小鼠的病變主要以直腸和左半結(jié)腸為主,而倉(cāng)鼠和豚鼠的病變則在盲腸和右半結(jié)腸比較明顯。DSS誘導(dǎo)的炎癥發(fā)病及嚴(yán)重程度與DSS濃度及動(dòng)物種系有關(guān)。造模方法:1985年,Ohkusa最先在倉(cāng)鼠建立了DSS結(jié)腸炎模型,其后Okayasu和Cooper等學(xué)者亦先后在BALB/C、C57、SW等小鼠建立了DSS急慢性結(jié)腸炎模型。近年來(lái),國(guó)內(nèi)對(duì)DSS模型的研究越來(lái)越多,有學(xué)者根據(jù)Cooper的方法單次使用DSS建立急、慢性小鼠結(jié)腸炎模型:①將分子量為5000的DSS溶于飲用水,配成5%DSS溶液,讓BALB/C小鼠自由飲用7d,建立小鼠急性結(jié)腸炎模型;②讓BALB/C小鼠自由飲用5%DSS溶液7d,然后飲用不含DSS的蒸餾水14d,建立小鼠慢性結(jié)腸炎模型。結(jié)果:飲用5%DSS溶液7d,BALB/C小鼠可發(fā)生腹瀉、血便等癥狀,全結(jié)腸表現(xiàn)為以隱窩破壞為特征的多灶性小潰瘍,伴中性粒細(xì)胞為主的急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。停止飲用5%DSS溶液14d后BALB/C小鼠的腹瀉、血便等癥狀消失,全結(jié)腸表現(xiàn)為更局限的灶性小潰瘍伴鄰近上皮細(xì)胞再生、修復(fù),以及突出的隱窩扭曲變形伴以淋巴、單核細(xì)胞為主的慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),與Okayasu和Cooper觀察到的病變相似。該造模方法所致急、慢性期腸道病變均以遠(yuǎn)段結(jié)腸為重,而Cooper等用SW小鼠所建結(jié)腸炎模型的病變以近段結(jié)腸為重,進(jìn)一步證明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種系對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。該種造模方法耗時(shí)較以往多次循環(huán)使用DSS誘發(fā)慢性結(jié)腸炎明顯縮短,值得推廣應(yīng)用。DSS模型優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行,成功率高,重復(fù)性好,其癥狀、結(jié)腸肉眼病變和組織學(xué)改變均與人類UC相似,且可人為地反復(fù)以DSS刺激,產(chǎn)生類似人類UC急性期和緩解期的變化,是研究UC發(fā)病機(jī)制和藥物療效較理想的模型。其缺點(diǎn)是價(jià)格較高,且由于動(dòng)物飲水量無(wú)法精確控制,可能造成病變差異較大。4小鼠腸道炎癥模型OXZ是一種較新的IBD造模方法,其機(jī)制尚未闡明,經(jīng)免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn),OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型為Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng),細(xì)胞因子分泌以IL-4過(guò)量生成為主,可被轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-γ(TGF-γ)所對(duì)抗,后者限制病變程度和病期;也有學(xué)者認(rèn)為是宿主的NK細(xì)胞識(shí)別的腸道抗原由CD1遞呈,后者可表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和胃腸道上皮細(xì)胞,從而導(dǎo)致腸道炎癥。目前對(duì)這種模型的發(fā)病機(jī)制報(bào)道不多,有待廣泛、深入研究。造模方法:選用雄性SJL/J小鼠,乙醚麻醉后,經(jīng)肛門插管深入距肛緣4cm處,緩慢注入惡唑酮150μl(6mg溶于50%乙醇中),隨后將小鼠持續(xù)倒置30s。一般造模2d內(nèi)出現(xiàn)懶動(dòng)、腹瀉、肉眼血便,4d內(nèi)有50%左右死亡,存活的小鼠于第7天左右病情好轉(zhuǎn),10~12d基本痊愈,因此一般于造模后3d處死動(dòng)物,采集樣本。OXZ結(jié)腸炎模型區(qū)別于其他化學(xué)藥物誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的主要特征有:①OXZ誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)迅速,2d內(nèi)即達(dá)到高峰,出現(xiàn)消耗性血性腹瀉,小鼠或死亡,或完全復(fù)原。②病變主要出現(xiàn)于遠(yuǎn)端結(jié)腸,近端結(jié)腸無(wú)明顯炎癥表現(xiàn)。炎癥相對(duì)表淺,以淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞混合浸潤(rùn)為特征。③OXZ誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是典型的Th2型結(jié)腸炎。全身性使用抗IL-4治療可阻止結(jié)腸炎的發(fā)生,IL-12治療則無(wú)效,而抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)治療可導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥變化,病變累及全結(jié)腸。該法制作簡(jiǎn)單,模型產(chǎn)生快,重復(fù)性好,組織學(xué)特征、部位和細(xì)胞因子增殖情況均與人類UC相似,特別適合用于UC發(fā)病機(jī)制和新藥開(kāi)發(fā)的研究。缺點(diǎn)是疾病維持時(shí)間短,自愈性強(qiáng),無(wú)慢性期變化,不適合模擬慢性復(fù)發(fā)性類型的研究。5皮膚急性期dnpDNCB是一種小分子化學(xué)物質(zhì),它可以作為半抗原與組織蛋白結(jié)合成完全抗原,激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。最初是由Bick等于1964年在豚鼠建造,以后Rabin等對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn),并在兔身上成功制出UC模型。目前多在大鼠身上廣泛應(yīng)用。制作方法:取成年大鼠,頸背部脫毛,用2%DNCB丙酮液(DNCB2.0g,丙酮100ml)涂于該處皮膚,每天1次,每次0.3ml連續(xù)14d,第15~18天用直徑3mm的導(dǎo)管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8cm處,注入0.04mmol/L(0.1%)DNCB乙醇(50%)液0.25ml每天1次。該法自愈性較強(qiáng),目前一般與乙酸連用,第1~15天處理同前,第16天同部位注入8%乙酸溶液2ml,準(zhǔn)確計(jì)時(shí)15s后再用5ml生理鹽水沖洗。造模后1~2w即出現(xiàn)黏液膿血便或糞便稀溏癥狀,可持續(xù)16w以上,有急性發(fā)作和慢性發(fā)展過(guò)程。乙酸作用后可見(jiàn)急性期病理表現(xiàn)。2~5w后轉(zhuǎn)為慢性期表現(xiàn),潰瘍愈合,但慢性炎癥持續(xù)存在。本模型成功率高,重復(fù)性好,病程長(zhǎng),病理學(xué)變化與人類相似,由遲發(fā)過(guò)敏反應(yīng)引起發(fā)病,提示外源性抗原和機(jī)體自身抗原對(duì)免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期刺激可誘發(fā)IBD,為理想的免疫反應(yīng)模型,有利于揭示IBD的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。缺點(diǎn)是制作過(guò)程繁瑣,周期較長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)者需反復(fù)摸索DNCB的濃度、劑量、作用時(shí)間,且DNCB毒性大,動(dòng)物死亡率高。6具有中醫(yī)癥狀特征的ibd模型6.1巖肉中主要癥狀王玉良等用20%番瀉葉浸劑灌服豚鼠,3d后肛門注入5%冰乙酸0.1ml,復(fù)制了辨證與辨病相結(jié)合的豚鼠脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎模型。實(shí)驗(yàn)組造模動(dòng)物在灌服番瀉葉3天后陸續(xù)出現(xiàn)便溏、納呆、消瘦、畏寒、拱背、懶動(dòng)、毛失光澤、精神萎靡等脾虛癥狀。冰乙酸對(duì)照組與空白對(duì)照組無(wú)上述癥狀,實(shí)驗(yàn)組和冰乙酸對(duì)照組注入冰乙酸后2~3d出現(xiàn)黏液便、有的帶血性分泌物,有的出現(xiàn)腹脹。造模第8天可見(jiàn)腸黏膜大面積水腫,不同大小的潰瘍?cè)?。病理切片可?jiàn)黏膜、黏膜下層水腫,充血,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。黏膜上皮脫落,潰瘍形成。本模型癥狀與臨床脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎相符,病理改變與臨床一致。6.2疏肝健脾治療組顧立剛等將大鼠每天不定時(shí)放入特制圓形箱內(nèi)限制活動(dòng)和飲食,并用膠布束綁大鼠后肢,每天約8h,3w后用5%醋酸1ml灌入結(jié)腸內(nèi),連續(xù)3w。結(jié)果顯示,模型組大鼠體重下降,糞便溏泄,腎上腺重量增加,胸腺重量下降;脾T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)能力明顯下降;全血黏度升高,血中紅細(xì)胞減少,白細(xì)胞增加,下丘腦單胺類激素如去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺均升高。結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、水腫、潰瘍等。以上各項(xiàng)均比單純醋酸誘導(dǎo)組改變明顯,用疏肝健脾方藥治療后上述指標(biāo)改善明顯。顧立剛、王玉良等分別在乙酸模型的基礎(chǔ)上建立了肝郁脾虛型和脾虛型UC模型,為更好的研究