高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定小柴胡顆粒中4種黃酮類(lèi)成分

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定小柴胡顆粒中4種黃酮類(lèi)成分

小柴胡粒是東漢張仲景在《傷寒論》中提出的中藥。柴胡是王藥，黃甘草是孫藥。它具有解表、清熱、平肝、健胃的功效。現(xiàn)代藥理研究表明小柴胡湯具有較好的解熱、抗炎、抗抑郁、抗病毒等作用,體外對(duì)多種細(xì)菌的抑制作用明顯,對(duì)肝臟、胰腺、肺臟和胃腸功能有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用,臨床應(yīng)用較為廣泛?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部中小柴胡顆粒項(xiàng)下僅規(guī)定對(duì)樣品中柴胡、黃芩、甘草進(jìn)行定性鑒別,含量測(cè)定僅要求黃芩苷不得少于20.0mg/袋。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定其中的7個(gè)指標(biāo)成分甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素,并比較不同廠家及同一廠家不同批次小柴胡顆粒中指標(biāo)成分的質(zhì)量差異,為更全面控制小柴胡顆粒的質(zhì)量提供參考依據(jù)。1藥品、試劑和試藥Agilent1260高效液相色譜儀、G1314BVL泵(美國(guó)安捷倫公司);BT—125D十萬(wàn)分之一電子天平平((賽賽多多利利斯斯公公司司));;KKHH55220000EE型型超超聲聲波波清清洗洗器器((昆昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。黃芩苷(批號(hào)110715-201117)、黃芩素(批號(hào)111595-201105)、漢黃芩素(批號(hào)111514-201016)、甘草苷(批號(hào)111610-201106)、甘草酸銨(批號(hào)110731-201116)、柴胡皂苷a(批號(hào)110777-201108)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;漢黃芩苷對(duì)照品購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司,批號(hào)111014,質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.0%。乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為娃哈哈純凈水。本研究收集了市售11個(gè)不同廠家和部分廠家不同批次的小柴胡顆粒,購(gòu)自全國(guó)各地零售藥店,并將11個(gè)不同廠家的樣品隨機(jī)編號(hào),依次為S1~S11,見(jiàn)表1。同一廠家(S11)的樣品批號(hào)分別為110903、120202、120401、120301、111102。2萃取液bAgilentEclipseXDB-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為乙腈(A)–0.1%磷酸水溶液(B);梯度洗脫,0~10min,5%~17%A;10~20min,17%~19%A;20~55min,19%A;55~80min,19%~21%A;80~100min,21%~41%A;100~115min,41%~43%A;115~120min,43~55%A;體積流量:0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):210nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10μL。2.2混合對(duì)照品溶液精密稱取甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素對(duì)照品適量,精密稱定,用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.0750、0.5240、0.2600、0.0282、0.0510、0.1160、0.0294mg/mL的混合對(duì)照品溶液;再精密吸取1mL該溶液,置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得混合對(duì)照品溶液,過(guò)0.22μm的微孔濾膜,取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液,備用。2.3超聲處理g取不同廠家及同一廠家不同批次小柴胡顆粒適量,研成細(xì)粉,取約5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入甲醇25mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理30min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,0.22μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液即得。2.4記錄色譜圖分別吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液,按照上述色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。結(jié)果表明甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素與其他組分均能達(dá)到較好的分離,且分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于5000。2.5小柴胡顆粒樣品測(cè)定2.5.1線性關(guān)系考察分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、16、18μL,依次注入高效液相色譜儀,記錄峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程及線性范圍,見(jiàn)表2。結(jié)果表明各成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)K12025的小柴胡顆粒樣品6份,制備供試品溶液,各吸取10μL,按上述色譜條件測(cè)定峰面積,結(jié)果甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為2.61%、0.80%、1.76%、2.40%、1.19%、2.53%、2.75%(n=6)。2.5.5回收率試驗(yàn)精密稱取批號(hào)K12025的小柴胡顆粒樣品6份,每份約5g,加入甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素對(duì)照品的質(zhì)量分別為0.47、10.21、2.21、0.55、1.14、0.32、0.34mg,制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算各指標(biāo)成分回收率,結(jié)果平均回收率分別為99.13%、99.60%、98.89%、99.65%、97.95%、100.37%、98.69%,RSD值分別為2.02%、1.59%、1.85%、2.27%、1.77%、1.49%、2.72%(n=6)。2.6不同廠家小柴胡顆粒主要營(yíng)養(yǎng)成分含量的差異取不同廠家和同一廠家(S11)不同批次的小柴胡顆粒制備供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,所得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表3~4。根據(jù)各廠家包裝規(guī)格折算,不同廠家小柴胡顆粒樣品中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.821~32.305mg/袋,差異較大。根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定本品含黃芩苷不得少于20.0mg/袋,因此,除了S2和S10廠家的樣品未能達(dá)到規(guī)定外,其他廠家的樣品均符合要求。除黃芩苷外,各廠家樣品中其他幾種指標(biāo)成分的差異也較大,甘草苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.095~2.690、1.080~4.970、0.740~1.750、0.740~4.870、0.135~1.130、0.240~0.920mg/袋,不同廠家的樣品差異較明顯。同一廠家(S11)不同批次小柴胡顆粒樣品中,甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素質(zhì)量分別為0.095~0.305、30.580~34.830、1.980~2.859、1.420~1.595、2.840~3.280、0.380~0.485、0.635~0.820mg/袋。與不同廠家樣品相比,同一廠家不同批次樣品的質(zhì)量差異相對(duì)較小。3色譜檢測(cè)波長(zhǎng)的確定為了盡可能多地體現(xiàn)小柴胡顆粒所含化學(xué)成分的特征,并結(jié)合其大多數(shù)成分為水提物的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑為無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、甲醇–水(7∶3)、甲醇–水(1∶1)的情況,其中無(wú)水甲醇提取物的色譜峰最多,故選擇無(wú)水甲醇溶液提取。采用了十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相柱,分別對(duì)甲醇–水、乙腈–水、乙腈–0.05%磷酸水和乙腈–0.1%磷酸水等體系進(jìn)行了梯度洗脫試驗(yàn),結(jié)果表明,乙腈–0.1%磷酸水系統(tǒng)有助于各色譜峰的分離,色譜峰最多,分離度最好?？疾炝?.5、0.8、1.0mL/min3種體積流量,結(jié)果表明最佳體積流量為0.8mL/min。依次考察了203、210、220、248、254nm等幾種不同的波長(zhǎng)對(duì)圖譜的影響,結(jié)果在210nm波長(zhǎng)下,色譜峰較多,兼顧了多種成分,各峰分離度良好,基線平穩(wěn),且210nm是小柴胡顆粒中主要成分柴胡皂苷的最大吸收波長(zhǎng),故選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定小柴胡顆粒中7種指標(biāo)成分甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素的HPLC方法,該方法科學(xué)合理,能相對(duì)較全面地反映小柴胡顆粒的內(nèi)在質(zhì)量,為客觀評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。2.1加樣穩(wěn)定性試驗(yàn)2.5.2精密度試驗(yàn)精確吸取混合對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷a和漢黃芩素峰面積的RSD值分別為0.70%、0.90%、0.81%、0.70%、0.79%、1.11%、0.26%(n=6)。2.5