天麻素對血管舒縮異常大鼠模型神經(jīng)肽、一氧化氮系統(tǒng)的影響

天麻素對血管舒縮異常大鼠模型神經(jīng)肽、一氧化氮系統(tǒng)的影響

目前，疼痛的研究主要集中在單一因素（csd）或疼痛的重要機制（三叉神經(jīng)血管理論）。于生元等建立了清醒狀態(tài)下血管源性頭痛大鼠模型,部分解決了偏頭痛反復發(fā)作問題。我們建立的血管舒縮異常大鼠模型,在一定程度上模擬了偏頭痛發(fā)病中的血管不同形態(tài)。既往研究表明降鈣基因相關(guān)鈦(CGRP)、內(nèi)皮素(ET)、β-內(nèi)啡肽(β-EP)、P物質(zhì)(SP)、一氧化氮系統(tǒng)在偏頭痛發(fā)病中具有重要作用,但是其與血管舒縮的相關(guān)性目前不知。中醫(yī)臨床實踐表明天麻素對偏頭痛有良好的臨床療效,具有獨特的優(yōu)勢。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)在血管收縮或舒張的情況下天麻素對血流速度均有不同程度的持續(xù)上調(diào)作用。本實驗在多巴胺(DA)、硝酸甘油(GTN)誘發(fā)血管舒縮異常大鼠模型的基礎(chǔ)上,通過對偏頭痛相關(guān)神經(jīng)肽、一氧化氮系統(tǒng)的研究,探討天麻素對其的干預作用,為臨床應用提供實驗依據(jù)。1材料表面1.1利華動物實驗SPF級SD雄性大鼠50只,北京維通利華動物實驗技術(shù)公司提供,許可證號為SCXK(京)2007-0001。分籠飼養(yǎng)于東直門教育部重點實驗室(普通級)。1.2實驗用試劑鹽酸氟桂利嗪膠囊(批號080802087)由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn),試驗用劑量0.9mg·kg-1。天麻素片(批號08HB)由昆明制藥集團股份有限公司生產(chǎn),試驗用大鼠劑量27mg·kg-1。鹽酸多巴胺(DA)注射液(批號080409)由廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn),實驗用劑量為20mg·kg-1。硝酸甘油(GTN)注射液(批號20080627)由北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn),實驗用劑量為10mg·kg-1。0.9%氯化鈉注射液(NS),批號為0806021W,北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),實驗用劑量2mL·kg-1。1.3免疫藥盒與免疫藥盒碘[125I]降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)放射免疫分析藥盒,碘[125I]內(nèi)皮素放(ET)射免疫分析藥盒,碘[125I]P物質(zhì)(SP)放射免疫分析藥盒,碘[125I]β-內(nèi)啡肽(β-EP)放射免疫分析藥盒,均由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供;一氧化氮(NO)檢測試劑盒(批號lot0903-2,普利萊基因技術(shù)有限公司),A014-1一氧化氮合成酶(NOS)總的測試盒(批號20090317,南京建成生物工程研究所)。1.4儀器、儀器和檢測設(shè)備300-100型CBI脈沖多普勒血流計(Triton技術(shù)有限公司),脈沖多普勒血流探頭(Lumen:1.5mm,Figure:E,Freq:20MHz;IOWADOPPLERPRODUCTS,USA),多導生理信號記錄儀(BIOPAC公司,主機為BIOPACSystemsMP100),LD5-2A型低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn)),LGR10-4.2型低溫高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠生產(chǎn))、Sn-695B型免疫計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司生產(chǎn))、723A可見分光度光度計(上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn))DR-HW-2型電熱恒溫水溫箱(北京市醫(yī)療設(shè)備總廠)、CliniBio128C酶標儀、KIM軟件(悅泰醫(yī)藥科(國際)有限公司)。數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)。2實驗方法2.1各組的給藥及灌胃大鼠隨機分為5組,每組10只,分別為溶媒組、DA組、模型組、鹽酸氟桂利嗪組、天麻素組。各組給藥6d,每日灌胃1次。鹽酸氟桂利嗪組、天麻素組按各自相應濃度的溶液灌胃。溶媒組、DA組、模型組均每日灌胃三蒸水1mL·100g-1。研究過程遵循實驗動物管理條例(1988年2號令)。2.2各組模型的建立各組在第7天灌胃后0.5h后開始戊巴比妥鈉麻醉(50mg·kg-1),左頸總動脈插管測血壓,右頸總動脈外套多普勒探頭測血流,肢體連接心電導聯(lián)電極,氣管插管。溶媒組:先皮下注射(sc)等體積0.9%NS(0.2mL·100g-1),間隔45min后皮下注射等體積0.9%NS,觀察60min。多巴胺組:皮下注射DA(20mg·kg-1),間隔45min后皮下注射0.9%NS,觀察60min。模型組:皮下注射DA(20mg·kg-1),間隔45min后皮下注GTN(10mg·kg-1),觀察60min。鹽酸氟桂利嗪組、天麻素組造模方法與模型組相同。各組實驗交叉進行,保證組間均衡,給藥與觀察者為同一人。造模過程進行血流動力學監(jiān)測。2.3抗凝血漿及血清的制備各組在完成血流動力學監(jiān)測后1h(即GTNsc后2h),取腹主動脈血2mL,注入含有7.5%EDTA二鈉30μL和抑肽酶40μL的冰冷離心試管中,輕輕搖勻,低溫離心機,4℃、3000r/min,離心5min,分離出1mL抗凝血漿(供CGRP、ET、SP、β-EP檢測用);取腹主動脈血2mL,注入離心試管中(供NO、T-NOS、iNOS、cNOS檢測用),靜置0.5h,常溫離心機,3000r/min,離心10min,分離出血清1mL,所有抗凝血漿及血清按編號放入-20℃低溫冰箱中貯存、備用。取血后,即刻將動物斷頭處死,取腦,去除腦膜和血管,液氮罐中貯存、備用。2.4指標報告2.4.1cep、et、sp、s-ep2.4.2rt-pcr方法的檢測c-fosmrna表達各組隨機抽取3個樣本(共15個樣本)采用RT-PCR技術(shù)進行中腦c-fosmRNA表達檢測。自液氮貯存罐中轉(zhuǎn)移出組織塊稱重,用Trizol法提取總RNA,應用北京博邁德科技發(fā)展有限公司的PCR引物,擴增產(chǎn)物長度為466bp。以GAPDH作為內(nèi)參照,以RT-PCR方法檢測c-fosmRNA的相對表達量。RT條件:42℃,60min→70℃,10min;PCR條件:94℃預變性5min→94℃,30s→55℃,30s→72℃,45s,共35循環(huán),最后72℃,10min。取PCR產(chǎn)物20μL在1.5%瓊脂糖凝膠自動圖像分析儀掃描,應用QuantityOne圖象分析系統(tǒng)對RT-PCR產(chǎn)物進行分析,計算條帶的積分吸光度(IA),IA值為平均吸光度×面積。2.5組間比較及數(shù)據(jù)處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析。正態(tài)計量資料用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較(≥3)采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD法;方差不齊(P>0.05為方差齊)取對數(shù)及開方等數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換或采用Games-Howell檢驗。計數(shù)資料用頻數(shù)來表示,雙側(cè)檢驗,顯著性水平P<0.05。3結(jié)果3.1各組et的比較DA、GTN誘發(fā)的血管舒縮異常模型大鼠神經(jīng)肽的表達不一,與溶媒組相比,模型組ET含量降低(P<0.05),β-EP及SP含量升高(P<0.05)。與模型組比較,鹽酸氟桂利嗪組、天麻素組ET表達均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);多巴胺組、鹽酸氟桂利嗪組、天麻素組β-EP含量均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);鹽酸氟桂利嗪組SP含量降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CGRP各組組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但是模型組有升高的趨勢。見表1。3.2模型組inos含量表達的變化DA、GTN誘發(fā)的血管舒縮異常模型大鼠各組TNOS、iNOS、cNOS比較差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),但是與溶媒組相比,模型組iNOS含量表達有增多的趨勢。各組NO組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組NO較溶媒組表達升高,天麻素組NO含量較模型組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而鹽酸氟桂利嗪組表達雖減少,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。3.3各組大鼠c-fosmna的比較DA、GTN誘發(fā)的血管舒縮異常模型大鼠給予GTN后2h各組中腦c-fosmRNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中模型組表達增多,溶媒組、多巴胺組、鹽酸氟桂利嗪組和天麻素組c-fosmRNA與其相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖1。4內(nèi)鏡存在的問題神經(jīng)源性炎癥(NI)是三叉神經(jīng)血管學說(TVS)的主要內(nèi)容。硝酸甘油甘油模型較好地驗證了神經(jīng)源性炎癥在偏頭痛頭痛發(fā)作中的作用。結(jié)合GTN模型研究成果和以往研究基礎(chǔ),我們通過皮下注射DA,間隔45min再次注射GTN建立具有時相性特點的血管舒縮異常偏頭痛大鼠模型,既可以觀察藥物對血管不同狀態(tài)的影響,又可以驗證其對神經(jīng)源炎癥的影響。本實驗研究發(fā)現(xiàn)模型組ET含量降低(P<0.05),SP含量升高(P<0.05),而CGRP含量雖有增高的趨勢,但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ET目前所知的最強的血管收縮劑,腦血管是ET-1最敏感的效應器官之一。在正常狀體下,它與CGRP等物質(zhì)保持一定的穩(wěn)態(tài),一般來說,ET-1釋放量很低,主要維持血管系統(tǒng)的張力。該物質(zhì)含量的降低表明血管舒縮處于一種“失衡”狀態(tài),可成為神經(jīng)源性炎癥的刺激因素,c-fos的激活可能與此有關(guān)。同時該研究結(jié)果與姚干等運用GTN誘導的偏頭痛大鼠模型結(jié)果(GTNsc4h取材,頸部動靜脈血)相一致。SP存在于初級感覺神經(jīng)元,作為感覺信息的傳遞者在三叉神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)傳遞傷害傳導,并且直接擴張血管,在血漿蛋白外滲(PPE)的形成過程中發(fā)揮重要作用。CGRP和SP共存于同一細胞中,兩者可反映三叉神經(jīng)節(jié)的活性。CGRP雖有增高的趨勢,但與溶媒組比較卻沒有差異,與偏頭痛發(fā)作其升高的現(xiàn)象不符合?？紤]其原因有三,首先是取血時機的選擇,CGRP受到刺激后在中樞的表達有一個時間進程,8h達到高峰,然后下降,48h恢復正常。本實驗在注射GTN后2h取血,可能這個時間點CGRP表達沒有增強。其次CGRP的代謝周期比較短,在人血液循環(huán)中生物半衰期為7～10min,如果在其代謝結(jié)束時取血,表達可能與溶媒組相似。最后取血部位的影響,臨床CGRP相關(guān)研究取材部位一般為頸靜脈血或肘靜脈血及腦脊液,本實驗取材部位為腹主動脈,該部位血中的CGRP可能已經(jīng)降解。本實驗研究發(fā)現(xiàn)模型組NO表達增多,iNOS含量表達有增多的趨勢,但是與溶媒組相比差異沒有統(tǒng)計學意義。NO可激活鳥苷酸環(huán)化酶(GC),升高細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)水平,抑制細胞Ca2+內(nèi)流,降低細胞膜K+通道的活性,從而使血管平滑肌松弛。硬腦膜是頭痛的主要疼痛結(jié)構(gòu),其粗大的動脈為硬膜中動脈,NO使其血管平滑肌松弛,在臨床上表現(xiàn)為搏動性頭痛。目前已發(fā)現(xiàn)3種NOS,分別是內(nèi)皮細胞型NOS、神經(jīng)元型NOS、誘導型NOS。前兩者是鈣依賴性的生理性NOS,iNOS是非鈣依賴的病理性NOS。iNOS主要存在于巨噬細胞、肥大細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等,其基礎(chǔ)狀態(tài)下活性幾乎可以忽略不計,但在脂多糖或細胞因子如γ干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等刺激下,活性明顯增加。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組iNOS表達盡管有升高的趨勢,但與溶媒組表達類似,與NO的升高不成比例。考慮原因由取材部位所引起。文獻報道iNOS表達多在硬膜。故本實驗的樣本來源是腹主動脈血清,所以iNOS表達與溶媒組相似。β-內(nèi)啡肽(β-EP)紊亂也是疼痛發(fā)生的主要原因。β-EP是主要來源于腦垂體,平時少量釋放,在疼痛、中毒等應激狀態(tài)下釋放增加。β-EP含量的減少會導致“鎮(zhèn)痛效應”的減弱引起頭痛的發(fā)生,但是應激會導致β-EP的過度釋放,導致腦組織的損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組β-EP含量明顯增多,其機制主要由應激所致。DA、GTN引起的血管劇烈舒縮,導致一些神經(jīng)肽的內(nèi)環(huán)境紊亂,促進β-EP釋放增多。與有關(guān)報導相符合。β-EP增加具有開放鈣通道、調(diào)節(jié)內(nèi)皮素釋放、抑制呼吸中樞介導CO2潴留致腦血管擴張、激活阿片受體等多種生理效應,在偏頭痛中發(fā)揮著重要作用。Fos蛋白是c-fos基因的產(chǎn)物,調(diào)節(jié)著其他基因的轉(zhuǎn)錄,屬于即刻早期反應基因。c-fos是神經(jīng)元損傷激活的標志。Fos的免疫反應性為神經(jīng)元亞群受到傷害性刺激和相關(guān)傷害路徑判定提供了一個很好的鑒別方法。在偏頭痛的疼痛路徑中(導水管周圍灰質(zhì)、下丘腦)應用甚廣。本實驗采取RT-PCR技術(shù)對中腦c-fos表達進行檢測,模型組表達增多,與溶媒組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明該模型在注射后GTN后2hc-fosmRNA表達開始增多,疼痛傷害路徑開始激活。鈣通道在整個偏頭痛發(fā)病中具有重要的作用,其阻滯劑可能具有收縮血管平滑肌、干預皮層擴散的形成和擴散、干擾神經(jīng)血管炎癥等作用。本實驗結(jié)果提示鹽酸氟桂利嗪具有以下作用:(1)改善低ET狀態(tài),抑制過高的SP,降低過高的β-EP,使神經(jīng)肽恢復穩(wěn)態(tài);(2)抑制c-fosmRNA的表達。表明鹽酸氟桂利嗪對偏頭痛的預防作用可能通過神經(jīng)肽的調(diào)節(jié)、c-fosmRNA的下調(diào)發(fā)揮預防偏頭痛作用。偏頭痛屬于中醫(yī)“頭風”、“腦風”等范疇,幾千年的臨