氯羥吡啶衍生物的合成及抗血清的免疫研究

氯羥吡啶衍生物的合成及抗血清的免疫研究

氯羥吡啶也被稱為克球酚，它被稱為3、5-二氯二氯二和6-4-硝基吡啶。這是一種由磺酰胺類、5-羥色胺和6-硝基二氯二氯-4引起的預(yù)防家禽株昆蟲疾病的藥物添加劑。研究結(jié)果表明,氯羥吡啶對大鼠有一定致畸和胚胎毒性作用(姜中其等,1999),對小鼠有弱致突變作用(包鴻俊等,1992)。沈建忠等(1997)所做雞代謝試驗也表明,該藥物主要殘留于肝臟和肌肉,停藥7d后仍能在試驗動物組織內(nèi)測定到較高含量藥物。正是由于長期使用或不按規(guī)定用藥造成氯羥吡啶在動物體內(nèi)和組織中殘留以及由此對人體造成的潛在威脅,目前歐盟、美國、加拿大、日本以及中國等都規(guī)定了各種動物組織中氯羥吡啶殘留最高限量標(biāo)準(zhǔn)(李俊玲,2005)。氯羥吡啶的常規(guī)檢測方法主要有氣相色譜法(Ekstr?m等,1984)、高效液相色譜法(農(nóng)牧發(fā)38號,2001)、氣相色譜質(zhì)譜法(He等,2005)和液相色譜質(zhì)譜法(Pang等,2000)。這些儀器方法主要依賴于大型進口設(shè)備,是目前國家級檢測單位和各級政府、出入境等檢測單位的常用方法,眾多相關(guān)國家、地方和行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)均是以這些方法為基礎(chǔ)(GB/T20362,2006)。其檢測結(jié)果準(zhǔn)確,但操作復(fù)雜,尤其是儀器設(shè)備采購成本高,維護成本更高,一般企業(yè)和基層檢測單位難以承受。由于中國養(yǎng)殖模式復(fù)雜,散養(yǎng)模式依然占據(jù)主流地位,因此要控制相關(guān)藥物殘留,確保上市產(chǎn)品達(dá)標(biāo),推廣快速方便,適合于基層檢測單位使用的方法和手段勢在必行。目前報道的快速檢測方法有電化學(xué)法(柴春彥等,2006)和酶聯(lián)免疫吸附測定法等(謝忠良,2009)。其中ELISA法是目前在食品安全檢測領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛和成熟的技術(shù)之一(張也等,2003),其檢測方便、操作簡單、成本低、耗時短、無須昂貴儀器等,已經(jīng)被廣泛接受而作為快速篩選方法而列入國標(biāo)中(農(nóng)業(yè)部1025號公告,2008)。本研究旨在合成氯羥吡啶抗原和制備相應(yīng)抗血清,為ELISA檢測方法建立奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1其他抗基因藥物氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品、尼卡巴嗪、氯苯胍、地克珠利和磺胺喹惡啉等標(biāo)準(zhǔn)品采購自Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三正丁胺等購自某化學(xué)有限公司;血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)購自上海某生物科技有限公司;羊抗鼠酶標(biāo)記和羊抗兔酶標(biāo)記二抗購自北京某公司;單組份TMB底物購自北京某公司;其余試劑購自北京化學(xué)試劑公司。除特殊說明外,試驗所用水為三蒸水,化學(xué)試劑為分析純。1.1.2水質(zhì)、酶標(biāo)板和動物紫外分光光度計為日本某公司產(chǎn)品,MK3酶標(biāo)儀購自熱電公司,XevoTQ-S質(zhì)譜購自美國Waters公司,酶標(biāo)板為熱電公司產(chǎn)品,BALB/c小鼠由北京某生物技術(shù)有限公司友情提供。1.2方法1.2.1氯乙酸鈉溶液配制氯羥吡啶分子結(jié)構(gòu)簡單,沒有羧基或氨基等活性基團,無法直接與蛋白偶聯(lián)。本研究在其羥基上延伸,構(gòu)造出含有羧基的氯羥吡啶衍生物(圖1),具體操作為:取4.8g(25mmol)氯羥吡啶原料,加入到氫氧化鉀2.8g(50mmol)用15mL水溶解,使之溶解,用20mLDMF充分?jǐn)嚢柘♂?加入無水碘化鈉0.11g(0.73mmol)攪拌,取3.48g(30mmol)氯乙酸鈉溶于5mL去離子水,緩慢加入到氯羥吡啶溶液中,用油浴升溫,60℃攪拌充分?jǐn)嚢柽^夜12h。反應(yīng)結(jié)束后,旋蒸干燥除去溶劑與水,得到淺黃色固體,加適量約30mL水溶解,調(diào)節(jié)pH到5左右,有大量白色固體析出,過濾除去水溶液,反復(fù)用20%乙醇溶液沖洗3次,再用去離子水20mL沖洗抽濾去清液,除去無機鹽,過量氯乙酸鈉等雜質(zhì),得白色固體粉末,烘干即為氯羥吡啶半抗原粗品。將所得半抗原用質(zhì)譜進行掃描分析,確定合成結(jié)果。1.2.2偶聯(lián)產(chǎn)物clop-bsa的合成采用活性酯法合成氯羥吡啶人工免疫原,操作如下:準(zhǔn)確稱取75mg氯羥吡啶半抗原溶解于5mLDMF中,加入62.5mg二環(huán)已基碳化二亞胺(DCC)和34.5mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS),在室溫下磁力攪拌下反應(yīng)過夜12h,此液稱為A。另稱取150mgKLH溶于5mL碳酸鈉緩沖液(0.05mol/L,pH9.6),此液為B。將反應(yīng)液B放置于磁力攪拌器上4℃平衡1h后,將反應(yīng)液A緩慢滴加到反應(yīng)液B中,攪拌反應(yīng)過夜。再將反應(yīng)液置于經(jīng)預(yù)處理過的透析袋內(nèi)用磷酸鹽緩沖液(0.02mol/LpH7.4)4℃透析5d,得到偶聯(lián)產(chǎn)物CLOP-KLH,分裝后凍存于-20℃?zhèn)溆?。采用氯甲酸異丁酯法合成氯羥吡啶人工包被原,操作如下:準(zhǔn)確稱取75mg氯羥吡啶半抗原溶解于5mLDMF中,4℃下磁力攪拌,先滴加入150μL三正丁胺,反應(yīng)30min,再加入100μL氯甲異丁酯,攪拌反應(yīng)1h,此為反應(yīng)液A。另稱取200mgBSA溶于10mL碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH9.6)中,放入冰箱中預(yù)冷1h,此為反應(yīng)液B。在4℃冰箱中磁力攪拌下,將反應(yīng)液A緩慢滴加到反應(yīng)液B中,繼續(xù)4℃攪拌反應(yīng)過夜。再將反應(yīng)液置于經(jīng)預(yù)處理過的透析袋內(nèi)用磷酸鹽緩沖液(0.02mol/LpH7.4)4℃透析5d,得到偶聯(lián)抗原CLOP-BSA。分裝后凍存于-20℃?zhèn)溆谩?.2.3蛋白濃度的計算將抗原稀釋一定的倍數(shù),然后采用紫外分光光度法分別測定D280nm和D260nm,利用經(jīng)驗公式計算蛋白濃度(楊利國,1998)。根據(jù)測定結(jié)果將氯羥吡啶半抗原、BSA及偶聯(lián)物配制成固定濃度,然后掃描出半抗原及BSA的最大吸收波長,分別測定氯羥吡啶半抗原、BSA及偶聯(lián)物在兩最大吸收波長處的吸收值,根據(jù)楊利國等(1998)提供的方法計算偶聯(lián)比例。1.2.4小鼠分組及免疫將制備好的抗原用PBS稀釋至1mg/mL作為儲備液。分別以100μL和500μL的劑量皮下多點免疫BALB/c小鼠,免疫間隔為2周。3次免疫的第10天眼眶采血,間接法測定血清效價,同時測定抗血清對尼卡巴嗪、氯苯胍、地克珠利和磺胺喹惡啉等藥物的交叉反應(yīng)。2結(jié)果2.1出現(xiàn)理論分子質(zhì)量相同的代物抗原用質(zhì)譜掃描鑒定,結(jié)果見圖2。所合成的半抗原為氯羥吡啶的羥基取代物,其理論分子質(zhì)量為254,與圖中標(biāo)注峰值分子質(zhì)量相同,表明抗原合成成功。免疫抗原和包被原濃度經(jīng)紫外法測定分別為8.02mg/mL和5.23mg/mL,偶聯(lián)比率分別接近于15∶1和10∶1。2.2價值對d值的影響分別于第3次免疫、第4次免疫后測定效價,結(jié)果見表1。由表1可知,第3次免疫后血清效價為1∶1000時,D值較低(<0.6),但對20ng/mL的氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品抑制較好。第4次免疫后,血清效價普遍提高,5號血清效價最高,10ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品抑制達(dá)到47.2%。5號血清經(jīng)調(diào)試,測定交叉反應(yīng)和靈敏度(標(biāo)準(zhǔn)曲線),結(jié)果見表2和圖3。3討論3.1elisa法在食品篩選中的應(yīng)用中國畜禽業(yè)目前還以散養(yǎng)模式為主,多數(shù)養(yǎng)殖者技術(shù)水平有限,雖有食品安全意識但無科技知識,因此如何從基層和源頭控制食品安全才是實現(xiàn)安全食品的基礎(chǔ)。ELISA方法作為快速篩選方法尤其適合于基層應(yīng)用,作為一種快速篩選的檢測手段,可以有效地保障食品安全。氯羥吡啶殘留檢測目前還無市售試劑盒檢測產(chǎn)品,因此很有必要開發(fā)此類檢測產(chǎn)品,填補市場空缺,滿足基層食品安全檢測的需求。3.2氯羥吡啶半抗原的制備氯羥吡啶抗原合成的關(guān)鍵點有兩方面:(1)在于半抗原的制備,氯羥吡啶化學(xué)穩(wěn)定性較好,在常規(guī)有機溶劑中也很難溶解,只有在堿性條件下才有良好的溶解性。此外,該藥物分子結(jié)構(gòu)的活性基團不多,酚羥基的活性較弱,采用酸酐酰化的方法制備半抗原比較困難,因此采用含有鹵代烴的醋酸鈉在堿性條件下取代反應(yīng)得到氯羥吡啶半抗原后,用含乙醇的溶液清洗出去其它的溶劑和大部分雜質(zhì),無需過硅膠柱層析純化就可以得到氯羥吡啶半抗原。(2)人工抗原制備免疫原,采用血藍(lán)蛋白KLH作為載體蛋白具有良好的免疫原性,但KLH在純水中不好溶解,需要預(yù)先用緩沖液充分溶解,用經(jīng)典的DCC活性酯法偶聯(lián)全抗原可以得到較好的氯羥吡啶人工抗原,而包被抗原采用牛血清白蛋白BSA作為載體蛋白,和經(jīng)典的氯甲酸異丁酯法偶聯(lián)全抗原偶聯(lián)率也比較好。3.3單克隆抗體的制備本研究制備多克隆抗體前期選擇了新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,都得到了較好的測定結(jié)果。但由于單克隆抗體來源穩(wěn)定,在擁有雜交瘤細(xì)胞株的情況下可源源不斷地獲取抗體,所以試驗最終報告的是鼠血清結(jié)果。從該結(jié)果可以看出,鼠血清效價較高,同時氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)品抑制明顯,在10ng/mL抑制了47.2%,非常適合于單抗制備?？乖铣珊笾苽溲宓臏y定結(jié)果也