《生物化學(xué)》第10章復(fù)制

DNA的生物合成(復(fù)制)DNABiosynthesis，Replication

第十章CentralDogma描述遺傳信息流動(dòng)的方向1958年F.crick逆轉(zhuǎn)錄酶1970年對(duì)中心法則進(jìn)行了補(bǔ)充復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA第一節(jié)復(fù)制的基本規(guī)律BasicRulesofDNAReplication

一、半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和意義子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式密度梯度實(shí)驗(yàn)

DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。原核生物復(fù)制時(shí)，DNA從起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、雙向復(fù)制復(fù)制中的放射自顯影圖象A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。真核生物5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’三、復(fù)制的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

DNA復(fù)制的酶學(xué)TheEnzymologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dNTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈(ssDNA）引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質(zhì)因子一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)DNA新鏈生成需引物和模板；新鏈的延長只可沿5→3

方向進(jìn)行。二、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase,DDDP)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′

AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-pol

Ⅲ功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ（109kD）復(fù)制產(chǎn)生短片斷的DNA323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow

片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-pol

Ⅱ（120kD）

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

功能是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)復(fù)制產(chǎn)生長片斷的DNA（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀

（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀A：DNA-pol的外切酶活性切除錯(cuò)配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對(duì)的底物。B：堿基配對(duì)正確，DNA-pol不表現(xiàn)活性。（二）復(fù)制的保真性和堿基選擇?DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價(jià)（氫鍵）與共價(jià)（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。?嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對(duì)，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。1.遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2.聚合酶在復(fù)制延長時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；3.復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制

四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈引物酶(primase)——復(fù)制起始時(shí)催化生成RNA引物的酶單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整108局部解鏈（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

解鏈過程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

五、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。

DNA連接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能（一）復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5

3

5

3

1.DNA解鏈1）復(fù)制起始點(diǎn)的識(shí)別2）解螺旋酶解開雙鏈4）SSB參與維持DNA的單鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定3）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(可能主要是II型酶的作用)，在將要打結(jié)或已打結(jié)處作切口。

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB3

5

3

5

DnaA

DnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

2.引發(fā)體的形成含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引物酶復(fù)制是在一段RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，催化引物合成的是一種RNA聚合酶，它不同于催化轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶，因此稱為引物酶。

DDRP——DNAdependentRNApolymerase由于DDDP不可以催化兩個(gè)單dNTP之間的反應(yīng)，DDRP可以催化兩個(gè)NTP起始合成小的RNA片斷引物酶合成的小的RNA片斷稱為“引物”，為DNA的合成提供3’－OH3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶復(fù)制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制，在電子顯微鏡下均看到伸展成叉狀的復(fù)制現(xiàn)象，稱為復(fù)制叉。在DNA聚合酶III的作用下，新鏈第一個(gè)脫氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯鍵。復(fù)制開始。（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：DDDP沿著模板3’5’滑動(dòng)，第一個(gè)進(jìn)入配對(duì)的dNTP與RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯鍵，留下3’－OH繼續(xù)合成隨從鏈的合成——岡崎片段的形成兩條鏈?zhǔn)窃谕粋€(gè)DNA-polⅢ的催化下進(jìn)行延長的過程階段一階段二階段三階段四原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriterE.coli8232ori

terSV40500（三）復(fù)制的終止5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA連接酶隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接復(fù)制過程簡(jiǎn)圖哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

?細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。?真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。?復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。?增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（一）復(fù)制的起始3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復(fù)制的延長染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)?由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。?末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…功能?維持染色體的穩(wěn)定性?維持DNA復(fù)制的完整性端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成端粒酶的催化延長作用爬行模型DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工端粒維持著染色體的穩(wěn)定。端粒因細(xì)胞分裂而變短到一定程度時(shí)，細(xì)胞就會(huì)死亡。端粒破損會(huì)導(dǎo)致DNA變得脆弱、容易發(fā)生變異，可能導(dǎo)致一些與衰老有關(guān)的疾病，如動(dòng)脈硬化和某些癌癥。

逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)逆轉(zhuǎn)錄(reversetranscription)RNADNA

逆轉(zhuǎn)錄酶一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶有三種酶的活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性

逆轉(zhuǎn)錄酶

AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。

以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。

試管內(nèi)合成cDNAcDNA

complementaryDNARNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶

DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈DNA整合宿主DNARNA病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈的DNA，稱為前病毒，前病毒可以獨(dú)立繁殖在某些條件下，前病毒的基因組通過基因重組，參加到細(xì)胞基因組內(nèi)，并且隨著宿主的基因一起復(fù)制和表達(dá)——整合前病毒獨(dú)立繁殖或者整合，都可成為致病的原因反轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義

逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。

滾環(huán)復(fù)制(rollingcirclereplication)三、滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

是某些低等生物的復(fù)制形式，如

X174和M13噬菌體等。3

-OH5

-P5

5

5

3

3

3

3

5'滾環(huán)復(fù)制5'

5

3

3

5

dNTPDNA-pol

γ

D環(huán)復(fù)制(D-loopreplication)

是線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的復(fù)制形式。

DNA損傷（突變）與修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第五節(jié)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。

一、突變的意義（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)

二、引發(fā)突變的因素物理因素:紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV紫外線照射可引起核酸鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶形成二聚體TT（胸腺二聚體）?；瘜W(xué)因素三、突變的分子改變類型錯(cuò)配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

DNA分子上的堿基錯(cuò)配稱點(diǎn)突變(pointmutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。

2.顛換（一）錯(cuò)配鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

glu

·

glu

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·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DN