離子交換層析純化蛋白質(zhì)的工藝開發(fā)

離子交換層析純化蛋白質(zhì)的工藝開發(fā)離子交換層析分離蛋白的原理是基于其帶電性的不同，通過蛋白質(zhì)與帶電荷的層析填料之間的靜電作用力進行分離。IEX有以下三類：（1）陰離子交換層析（填料帶正電荷，與帶負電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）；（2）陽離子交換層析（填料帶負電，與帶正電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）。（3）復合型離子交換（填料配基基團中帶有苯環(huán)，以離子交換作用為主,同時有一定的疏水作用力）離子交換層析廣泛用于蛋白質(zhì)的分離純化，叢捕獲到精純階段都廣告使用，工業(yè)上60%以上的層析過程是離子交換層析。由于溶劑可以與蛋白質(zhì)相互交換氫離子，因此蛋白質(zhì)的帶電性受其溶劑pH值的影響。蛋白質(zhì)的等電點（pl）是蛋白質(zhì)不帶電時的pH值。當pH值高于pI時，蛋白質(zhì)會帶負電，而當 pH值低于pI時，蛋白質(zhì)帶正電。因此，可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來控制結(jié)合蛋白是與離子交換柱結(jié)合或是從柱上洗脫。

理論上來說，只要緩沖液pH值調(diào)節(jié)合適，所有的蛋白質(zhì)都可以與陽離子交換柱和陰離子交換柱結(jié)合。但是，蛋白質(zhì)純化過程中，選擇純化條件和層析柱類型時最重要的考慮因素就是要保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性是必須要考量的。蛋白質(zhì)與IEX的結(jié)合必須采用較寬pH值范圍的溶液進行多次嘗試以獲得最合適的蛋白質(zhì)保留pH值。毗-6FF相SF-6FF嚴用對比毗-6FF相SF-6FF嚴用對比tE予r 相眇-冊lai岸Mr2^gSSAl>L^5.TOO富itrT富itrT?補A#-iXK「加l」?inSiI/nin堿確林tsu,W■ 拠i哉E￡SP-fiFF3 ] I I i —…EX中最常用的4種帶電官能團如下所示。它們根據(jù)離子交換能力的強弱分類，強離子交換基團可離子化的pH范圍比弱離子交換基團的范圍更大。陰離子交換（固定相帶正電）：季銨（Q）-強陰離子交換基團二乙氨乙基（DEAE）-弱陰離子交換基團陽離子交換（固定相帶負電）：1.磺酸甲酯（S）-強陽離子交換基團2羧甲基（CM）-弱陽離子交換基團因為強離子交換基團的活性基團在很大的pH范圍內(nèi)均可保持帶電，它可以在蛋白質(zhì)結(jié)合所需pH值是特別強的酸性或堿性的情況下使用（假設該pH值下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性仍得以保持）。有些蛋白質(zhì)在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強度洗脫。由于高離子強度會影響部分蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而弱離子交換不需要在極端的pH值條件下進行蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此可能對蛋白質(zhì)更合適。離子交換色譜的固定相首先用低離子強度的緩沖液平衡，然后將蛋白質(zhì)樣品用和平衡過程相同離子強度的緩沖液上樣到固定相。結(jié)合的蛋白質(zhì)在用更高離子強度或pH值不同的緩沖液洗脫前先淋洗一段時間。洗脫緩沖

液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質(zhì)。在離子交換層析中，某些鹽類代替結(jié)合蛋白和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力，可能比其他種類的鹽可能更有效。NaCl或KC1是洗脫液中最常用的鹽類，其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子， Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面，還可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的 pH值來減少蛋白質(zhì)的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對于結(jié)合到陽離子交換固定相上的蛋白質(zhì),增加緩沖液pH值會使蛋白質(zhì)所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來。對于結(jié)合到陰離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，降低 pH值可減少蛋白質(zhì)所帶負電荷將其從柱上洗脫下來。同時，還可以調(diào)節(jié)緩沖液的pH值使目標蛋白質(zhì)不與離子交換固定相相結(jié)合，而與此同時雜蛋白與固定相結(jié)合。如此，可在穿透液中收集目標蛋白質(zhì)，而雜蛋白通過與固定相結(jié)合得以去除。與其他層析方法相比，離子交換層析在確定蛋白質(zhì)結(jié)合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的最佳條件時可能需要解決更多的問題。層析填料——吸附層析工藝開發(fā)運用實養(yǎng)設計袪快速高通益賠選s?快速篩選對合適的結(jié)合填科?嚅是初步的結(jié)合條件工藝幵發(fā)艮憂化DOEY.運用實養(yǎng)設計袪快速高通益賠選s?快速篩選對合適的結(jié)合填科?嚅是初步的結(jié)合條件工藝幵發(fā)艮憂化DOEY.回収耀純度.踣含載審警X緩沖阪.洗脫方式上祥過程中試放大固宏因盍：填料型號.祥品伏態(tài)，層析過程線性感大因素：體積吸附屢析填鞋髙通雖篩這:96孔版離心営SPE【重力柱）大多數(shù)蛋白可依據(jù)pl快速選擇離子交換填料緩沖液pH＞目的蛋白pI0.5-3個單位選擇弱陰離子交換填料(DEAE)緩沖液pH＞目的蛋白pI3個蛋白以上選擇強陰離子交換填料(Q)緩沖液pH＜目的蛋白pI0.5-3個單位選擇弱陽離子交換填料(CM)緩沖液pH＜目的蛋白pl3個單位以上選擇強陽離子交換填料(SP)緩沖液中含有較高離子強度時選擇復合型離子交換填料(MMC/MMA)根據(jù)pI選擇只能做為參考，不能完全依據(jù)pI選擇，因為蛋白是局部電荷和離子交換填料以靜電力的形式結(jié)合。根據(jù)離子交換填料的粒徑分布選擇，原則上粒徑越小分辨率越高?？焖俨东@選擇流速大的(BB165-300um)初步純化選擇粒徑適中的(FF45-165um)