通心絡(luò)對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

通心絡(luò)對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

與門靜脈相關(guān)的磁共振列車（p.0.05）的參與組一樣，參與組可以是控制組，參與組可以是正統(tǒng)級（p.0.05）的參與組。正統(tǒng)級hcy組的活動與hcy組的活動一樣，屬于正統(tǒng)級hcy組。生命。第四階段，m-a組的活動與hcy組（p.0.05）的活動相同。在同一時期，m-a組的活動與txl組的活動一樣，但生命。近年來研究發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的一個獨立危險因素,目前研究證明同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)能誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙。內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素,因此保護血管內(nèi)皮對于防治心腦血管疾病具有重要意。通心絡(luò)(TXL)是根據(jù)絡(luò)病理論而研制的復(fù)方制劑,通心絡(luò)膠囊是由人參、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣、蟬蛻、赤芍和冰片等中藥組成的中成藥。目前臨床與動物研究表明,通心絡(luò)具有抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊和調(diào)節(jié)血脂等功效,在心血管臨床應(yīng)用中具有顯著作用。但是,通心絡(luò)對Hcy損傷血管內(nèi)皮的保護作用機制尚不完全清楚。本研究擬通過體外細胞培養(yǎng)的方法,探討通心絡(luò)對Hcy損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的保護作用,了解通心絡(luò)的抗氧化作用機制,為通心絡(luò)臨床心血管疾病的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。1材料和方法1.1血清和mtt粉通心絡(luò)超微膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供。M199培養(yǎng)基、0.05%胰酶、I型膠原酶購自Gibco。胎牛血清購自Hyclone。ECGS、Hcy購自Sigma。MTT粉購自Amersco。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程所。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。RT-PCR試劑盒、SYBRGREENIrealMasterMix購自TOYOBO公司。1.2心絡(luò)超微粉制備通心絡(luò)超微粉溶液的制備用M199培養(yǎng)液溶解通心絡(luò)超微粉,配置為50g/L原液,室溫條件下,充分震蕩30min,超聲溶解1min,1kr/min離心10min,取上清用于細胞培養(yǎng)。1.3體外消化傳代健康新生兒臍帶取自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科;參考JAFFEA改良法,無菌收集新生兒臍帶,PBS緩沖液反復(fù)沖洗靜脈腔后灌注0.1%膠原酶消化30min,含10%血清的M199培養(yǎng)基終止消化,消化液1kr/min離心5min后加入培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù)細胞數(shù)量,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞貼壁并85%融合后,用0.05%胰酶消化傳代,培養(yǎng)條件同上。HUVEC經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)鑒定,流式細胞術(shù)CD34檢測證實陽性,選擇生長良好的第3～5代用于實驗。1.4阿托伐他汀對huvic增殖的保護作用HUVEC按每孔1×104接種于96孔板中,(1)Hcy對HUVEC的損傷作用:終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/LHcy作用48h后用MTT法測定細胞存活率。(2)通心絡(luò)對HUVEC的保護作用:0.5mmol/LHcy+TXL1、2、3、4、5、6、7和8g/L,作用48h后用MTT法測定細胞存活率。(3)阿托伐他汀(ATV)對HUVEC的保護作用:對照組(0.5mmol/LHcy),ATV分為0.1、1、10和100μmol/L,各組均加入0.5mmol/LHcy,作用48h后用MTT法測定細胞存活率。每孔加入20μLMTT(5g/L)孵育4h后,棄上清,加入100μLDMSO,于脫色搖床充分振蕩15min,使結(jié)晶體充分溶解,采用酶標(biāo)儀波長490nm測定各孔光密度值(D)。HUVEC增殖率(%)=(實驗組D值-對照組D值)/對照組D值×100%。每組設(shè)5個復(fù)孔及空白對照,重復(fù)3次。1.5tiascript-mlv的合成細胞同步化后,分為對照組(培養(yǎng)液不加干擾因素)、Hcy組(5mol/L)、通心絡(luò)組(Hcy0.5mol/L+TXL5g/L)和阿托伐他汀組(Hcy0.5mol/L+ATV10mmol/L),上述各組藥物孵育48h進行實時定量PCR。①總RNA的提取:用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。②互補DNA(cDNA)合成:5μg總RNA,2μLOligo-dt,2μLdNTP混合物,補足RNAse-free水至14μL,溫和混勻,70℃預(yù)變性5min后迅速冰上冷卻2min。加入5μL5×FirststrandBuffer,1μLTianScriptM-MLV(200U),總體積為25μL。25℃溫浴10min。42℃溫浴50min。95℃加熱5min終止反應(yīng)。③SYBRGreenRT-PCR(SYBRGreenRT-PCR日本TOYOBO公司)1μLcDNA,上下游引物(10μmol/L)各0.4μL,蒸餾水8.2μL,SYBRGreenRealtimePCRMasterMix10μL。反應(yīng)體系50μL。循環(huán)條件:95℃60s,95℃15s、60℃15s、72℃45s×40循環(huán),在ABIprism7000熒光定量PCR分析儀進行擴增及定量分析。本實驗設(shè)定β-actin為管家基因。β-actin引物上游序列為5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游序列為5′-TCCATGCCCAGGAAGGAAGG-3′。SOD引物上游序列為5′-AGGCCGTGTGCGTGCTGAAG-3′,下游序列為5′-CACCTTTGCCCAAGTCATCTGC-3′。④分析與統(tǒng)計,反應(yīng)結(jié)束后由計算機自動計算定量結(jié)果,用ΔΔCt方法進行計算和統(tǒng)計。1.6阿托伐他汀對sod和丙二醛試劑的實驗細胞同步化后,分為對照組(培養(yǎng)液不加干擾因素)、Hcy組(5mol/L)、通心絡(luò)組(Hcy0.5mol/L+TXL5g/L)和阿托伐他汀組(Hcy0.5mol/L+ATV10mmol/L),上述各組藥物孵育48h后,提取實驗組細胞培養(yǎng)液利用SOD和丙二醛試劑盒進行檢測。SOD測定用黃嘌呤氧化酶法按操作步驟進行,于550nm處分光光度計測定吸光度。丙二醛的測定用硫代巴比妥酸法按操作步驟進行,于532nm處分光光度計測定吸光度。1.7實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)以ˉx±sxˉ±s表示,組間比較用單因素方差分析,多重比較采用LSD法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1hcy對huvic細胞活力的影響0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L的Hcy處理48h后,可抑制細胞增殖,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.05,n=5;圖1),選取病理生理濃度Hcy0.5mmol/L做為內(nèi)皮細胞損傷模型濃度。HUVEC的細胞活力比Hcy組明顯增加(P<0.05,n=5;圖2),并且在5g/L時細胞活力達到最大(P<0.01,n=5),但隨著濃度增加,HUVEC增長能力并不隨著增加。故本實驗采用5g/L通心絡(luò)濃度作用HUVEC。用不同濃度的阿托伐他汀及0.5mmol/L的Hcy與HUVEC共孵育48h后細胞活力與Hcy組相比,隨著阿托伐他汀濃度逐漸增大,細胞活力逐漸增強,其中1μmol/L和10μmol/L阿托伐他汀組的細胞活力比對照組明顯增強(P<0.05,n=5;圖3)。2.2各組丙二醛水平比較與對照組比較,Hcy組的丙二醛水平顯著增加(P<0.01),通心絡(luò)組和阿托伐他汀組的丙二醛水平較Hcy組顯著減少(P<0.01),且對照組、通心絡(luò)和阿托伐他汀組之間丙二醛水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05;表1)。2.3兩組兩組p>0.1的比較Hcy組細胞培養(yǎng)液的SOD活性及細胞內(nèi)的SODmRNA表達水平均顯著低于對照組(P<0.01);通心絡(luò)組SOD活性及SODmRNA表達水平較Hcy組明顯提高(P<0.01),且對照組、阿托伐他汀組之間的表達水平之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05;表2)。3通心絡(luò)膠囊治療阿托伐他汀的作用機制高同型半胱氨酸血癥是動脈粥樣硬化的獨立危險因子之一。血管內(nèi)皮細胞是Hcy的重要靶器官。血管內(nèi)皮細胞除了屏障作用,而且在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,包括調(diào)節(jié)血管張力,調(diào)節(jié)凝血纖溶平衡,參與炎癥和免疫反應(yīng)等。因此,血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素。本實驗證實,Hcy能抑制HUVEC的細胞活力,并隨著Hcy劑量加大,抑制程度逐漸增強。加入通心絡(luò)共孵育HUVEC后,隨著通心絡(luò)的濃度增加,細胞活力均逐漸增加,說明通心絡(luò)均可以抑制Hcy誘導(dǎo)的HUVEC的損傷作用,從而改善細胞活力。氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙的主要病因,也與As發(fā)生發(fā)展中多個環(huán)節(jié)如脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)。過多的活性氧通過介導(dǎo)低密度脂蛋白氧化、促進細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活化并激活炎癥相關(guān)基因的表達,促使單核細胞趨化并釋放炎性分子和細胞因子,促進血管平滑肌增殖、移行,從而改變內(nèi)皮細胞的功能,最終導(dǎo)致As形成。SOD是超氧離子歧化的必要催化酶,為體內(nèi)重要的自由基清除劑,能清除超氧陰離子自由基,減輕氧化應(yīng)激,具有保護作用。SOD的高低可以反應(yīng)機體內(nèi)抗自由基水平的高低。丙二醛的形成是自由基介導(dǎo)細胞膜損傷的主要環(huán)節(jié),丙二醛是脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物,其含量是衡量氧化應(yīng)激對機體損傷程度的可靠指標(biāo)。丙二醛能夠明顯引起心血管組織硬化并最終導(dǎo)致As。通心絡(luò)膠囊運用了中醫(yī)絡(luò)病理論研制的復(fù)方中藥制劑,臨床上治療冠心病具有顯著療效。在動物實驗中,通心絡(luò)明顯降低高脂飲食兔的血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和丙二醛水平,提高NO、SOD水平,從而達到保護血管內(nèi)皮的作用。另外,在體外細胞實驗中發(fā)現(xiàn),通心絡(luò)可以通過上調(diào)NOS-NO通路提高血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞活力及抗血栓能力,達到改善內(nèi)皮細胞功能的功效。目前多項研究證實:阿托伐他汀具有一系列獨立于降脂作用外的心血管保護作用,通過保護血管內(nèi)皮、抗炎、抗凝等途徑逆轉(zhuǎn)或延緩粥樣硬化病變。阿托伐他汀改善動脈內(nèi)皮功能的機制,目前研究主要包括增加NO的生物活性、增加Akt磷酸化、降低表皮生長因子(EGF)表達、抑制內(nèi)皮素生成、抗氧化等。故本實驗選取阿托伐他汀為陽性對照藥物。本實驗發(fā)現(xiàn),Hcy明顯抑制細胞SODmRNA表達,抑制細胞培養(yǎng)液SOD活性,使丙二醛生成增加,提示Hcy能誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞脂質(zhì)過氧化增加,進一步損傷內(nèi)皮細胞,與Tanriverdi等結(jié)果相似。當(dāng)通心絡(luò)與Hcy共孵育HUVEC后,Hcy誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激程度明顯減弱,SODmRNA表達增加,細胞培養(yǎng)液SOD活