苔蘚植物組織培養(yǎng)技術(shù)

苔蘚植物組織培養(yǎng)技術(shù)

苔蘚植物是現(xiàn)存陸生植物中最大的一個(gè)，約23萬多種，其次是植物，屬于高度和低生長群。它與維管束植物相反,配子體(植物體)發(fā)達(dá),孢子體退化附生,其植物體僅有擬莖、擬葉和擬根的分化,沒有形成完善的組織系統(tǒng)。由于苔蘚植物的結(jié)構(gòu)簡單,形態(tài)分化的樣式比較單純,染色體數(shù)目較少(一般n=6~10),在植物形態(tài)學(xué)與實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究上具有重要意義。有些苔蘚植物如地錢培養(yǎng)細(xì)胞葉綠體發(fā)育好,葉綠素含量高,是研究細(xì)胞生理生化特別是光合作用的一種好材料。另外,地錢細(xì)胞生長速度快,倍增時(shí)間短,可同步培養(yǎng),而且是單倍體細(xì)胞,可以作為研究遺傳特別是研究基因表達(dá)、調(diào)控的有用材料。在分子遺傳學(xué)中,發(fā)現(xiàn)小立碗蘚(Physcomitrellapatens)是迄今用同源重組發(fā)生頻率最高的高等植物,被稱為“新的綠色酵母”。從苔蘚植物組織培養(yǎng)中可以獲得各個(gè)發(fā)育時(shí)期的單細(xì)胞,這對植物的形態(tài)建成、內(nèi)部生理生化過程、染色體分析和遺傳變異等研究來說,可以提供材料。此外,苔蘚植物中含有許多具有生物活性的化合物,對疾病治療和蟲害防治有很好的效果,可以通過苔蘚植物組織培養(yǎng)大量生產(chǎn),因而,研究苔蘚植物組織培養(yǎng)也有很大的應(yīng)用價(jià)值。1植物苔蘚的來源苔蘚植物的組織培養(yǎng)起步較早,但是發(fā)展卻十分緩慢。這一方面與人們對苔蘚植物的認(rèn)識程度有關(guān),另一方面與苔蘚植物缺乏顯著的經(jīng)濟(jì)意義也有關(guān)系。這是苔蘚植物學(xué)研究在世界范圍內(nèi)相對落后的根本原因。19世紀(jì)以前人們對苔蘚植物的認(rèn)識僅限于從外形或者是從著生角度識別苔蘚植物。1753年林奈發(fā)表的《植物種志》中沒有解決苔蘚植物內(nèi)在的和與植物界中其他各大類群的關(guān)系,當(dāng)時(shí)甚至連苔類也沒確立。19世紀(jì)后期,法國、美國和德國相繼出版了一系列雜志,如1874年開始創(chuàng)刊的《苔蘚植物評論》,1898年出版的《苔蘚學(xué)家》等,促進(jìn)了苔蘚植物研究在全球范圍內(nèi)的開展。植物的組織培養(yǎng)首先是以苔蘚植物為材料開始的。Goebel早在1905年就已開始此項(xiàng)研究,并預(yù)言苔蘚植物的組織培養(yǎng)不但可以用到與苔蘚相關(guān)的植物上,也可用到其他高等植物上。1964年,Dominick報(bào)道了培養(yǎng)苔蘚的一種新方法,即用細(xì)菌濾器向培養(yǎng)瓶中注入新鮮培養(yǎng)液,這種方法既方便了各種培養(yǎng)基的配制,還可減少對培養(yǎng)物和培養(yǎng)基中高溫易分解成分的傷害。苔蘚植物愈傷組織是1957年由Allsopp從苔類植物的小葉苔(Fossombroniapusilla)和石地錢(Rebouliahemisphaerica)的孢子培養(yǎng)后首次獲得的,轉(zhuǎn)移到無機(jī)鹽培養(yǎng)基上可分化成正常的葉狀體。1960年,Ward用蘚類植物的金發(fā)蘚(olytrichumcommune)和波葉仙鶴蘚(Atrichumundulatum)的原絲體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)取得成功。1961年Lal用西亞立碗蘚(hyscomitriumcoorgense)配子體的葉和頸卵器壁的培養(yǎng)獲得愈傷組織。根據(jù)Ohta和Hirose的統(tǒng)計(jì),截至1982年人們已先后從5目7科的15種蘚類和4個(gè)目15種苔類中獲得了愈傷組織。1997年Socal等報(bào)道,他們從波葉仙鶴蘚、叢生真蘚(ryumcaespiticium)和金發(fā)蘚及提燈蘚(Plagiomniumaffine)的原絲體培育出配子體。同年,Kowalczyk等也報(bào)道他們從苔類的大萼苔(Cephaloziabiscupidata)誘導(dǎo)形成愈傷組織,并且再生出配子體。我國的苔蘚植物的組織培養(yǎng)研究相對較晚,報(bào)道很少。而且大部分是以孢子作為原始培養(yǎng)物的。1982年,包文美和陳發(fā)生直接將地錢(Marchantiapolymorpha)的配子體培養(yǎng)在花盆或木箱中,觀察其生活史中各個(gè)階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)。隨后又有人先后就葫蘆蘚(Funaria)的孢子在液體或瓊膠培養(yǎng)基上的形態(tài)發(fā)生、白齒泥炭蘚(Sphagnumgirgensohnii)孢子的培養(yǎng)及其原絲體的發(fā)育、培養(yǎng)基的pH值對苔蘚孢子萌發(fā)及原絲體生長的影響,以及6-BA、KT及鈣調(diào)蛋白專一性抑制劑氯丙嗪對組培葫蘆蘚芽分化的影響等問題進(jìn)行了研究。從整體上講,國內(nèi)對苔蘚植物的研究還相對落后,絕大部分培養(yǎng)用的都是孢子,直接用配子體(植物體)作為外植體培養(yǎng)的報(bào)道極少。2影響因素2.1無機(jī)和kn培養(yǎng)基的生長和形貌1960年Ward報(bào)道在耳葉苔(Fossombronia)的孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中加入0.2%的酵母提取液時(shí),會使無機(jī)鹽培養(yǎng)基上能夠正常發(fā)育的孢子形成一個(gè)大的直徑在5mm以上并且具有疣狀突起的球狀物。在同一試驗(yàn)中,當(dāng)加入NAA和胰蛋白胨時(shí),孢子的萌發(fā)速度并不加快,但后期葉集成簇,假根增多,再生頻率增加。培養(yǎng)基中無機(jī)鹽成分并非越全越好。Socal等用兩種不同類型的培養(yǎng)基MS和KN作試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),添加的無機(jī)元素和維生素類比MS少得多,甚至是根本不添加的KN培養(yǎng)基對苔蘚的培養(yǎng)最適合。Martin報(bào)道,對大多數(shù)種類的苔蘚植物來講,培養(yǎng)基濃度降為原來的10%對于其生長速度和形態(tài)幾乎沒有影響。Takami等用MSF培養(yǎng)基培養(yǎng)角苔(Anthocerospunctatus)時(shí)發(fā)現(xiàn),如果培養(yǎng)基中葡萄糖或蔗糖耗盡時(shí),即使放在光照條件下細(xì)胞也不會生長。由此可見,培養(yǎng)基類型及元素的用量因種類不同而異。2.2植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)Rani報(bào)道,濃度為10-5~10–8mol·L-1GA3能刺激蘚類植物小珠蘚(Bartramidula)形成配子囊,最適宜的濃度是10-7mol·L-1。Socal等報(bào)道,生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在愈傷組織的誘導(dǎo)中作用十分明顯。在MS培養(yǎng)基中添加1mg·L-12,4-D和KT很快就能形成愈傷組織,并且比僅在礦質(zhì)元素的培養(yǎng)基上生長的更迅速。對其他種類苔蘚生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(1mg·L-12,4-D和KT)僅刺激愈傷狀原絲體的發(fā)育(原絲體是愈傷組織形成的中間階段)。Selkirk在培養(yǎng)錢苔(Ricciaduplex)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),2,4-D濃度為0、0.1mg·ml-1時(shí),葉狀體在培養(yǎng)液的表面微微翹起;當(dāng)濃度為1mg·ml-1時(shí),葉狀體變得十分平直;濃度達(dá)到10mg·ml-1時(shí),形成小的、具有很多分枝的蓮座狀的外形,并且端部卷曲入培養(yǎng)液底部。李菁和劉應(yīng)迪用幾種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)影響蘚類生長的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),這些物質(zhì)劑量超過或未達(dá)到適宜濃度時(shí),蘚株的生長即出現(xiàn)抑制或受傷的現(xiàn)象,或促進(jìn)效應(yīng)不明顯。幾種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配合使用比單獨(dú)使用的效果好。GA3與6-BA配合處理的促進(jìn)效果較差,有時(shí)甚至不如單獨(dú)處理的效果好。由此可以看出,不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在苔蘚植物內(nèi)部存在著某種相互依賴、相互促進(jìn)或相互制約機(jī)制,從而產(chǎn)生一定的協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)。2.3附于植物中的植物有一些種類的苔蘚對溫度的依賴與春化處理相類似。如半月苔(Lunularia)、腐生苔(Cryptothallus)、片葉錢苔(Ricciacrystallina)和薄囊蘚(Leptobryum)需要的溫度,要么一直是低溫的,要么是先低溫后高溫,通過如此的溫度處理刺激配子囊的形成。在一些特殊苔蘚植物種類中,如葫蘆蘚、立碗蘚的配子囊只有在植物體處于溫度為7℃中才能形成。異毛蘚(Anisothecium)、叢本蘚(Anoectangium)和絲瓜蘚(Pohlia)放在3500lx持續(xù)光照和溫度為12、25、30℃3種溫度下培養(yǎng),結(jié)果異毛蘚的原絲體在12℃時(shí)生長極少,氣生組織高度退化,匍匐組織由深綠色的具較少分枝的細(xì)絲組成。25℃中的原絲體生長良好,兩種組織的發(fā)育也很好,原絲體呈綠色,分枝很多。30℃下生長很差,原絲體呈褐綠色,氣生分枝很少。芽的形成也是在3種溫度下進(jìn)行,結(jié)果25℃下芽的數(shù)目最多,芽在12、25和30℃培養(yǎng)條件下分別在31、15和19d后產(chǎn)生,并且都發(fā)育成正常的芽。平均芽長度分別是3.8、5.0和4.1mm。絲瓜蘚原絲體的生長隨溫度的升高而減緩,12℃下,匍匐組織呈深綠色,氣生組織幾乎沒有,分枝極少,并且一些長入培養(yǎng)基里;25℃下,原絲體呈褐綠色,生長很好,兩種組織發(fā)育都很好,分枝十分豐富;30℃下再生十分緩慢,細(xì)絲呈黃褐色。芽在所有的溫度中都能形成,以25℃為最適。2.4光照對原絲體生長和發(fā)育的影響苔蘚植物中的苔類與蘚類都屬于陰生植物。它們比其他高等植物需要的光照度低。對于大多數(shù)種類來說,2000lx的光照度就足以滿足其生長需要。較高的光照度對其有傷害作用。Vashistha和Chopra曾設(shè)計(jì)了一個(gè)試驗(yàn),用5個(gè)不同照度的連續(xù)光,光照度分別是700、1100、2200、3500和4500lx,溫度在25℃左右,結(jié)果表明異毛蘚的原絲體在黑暗條件下不能再生,當(dāng)光照度達(dá)到3500lx時(shí)全部原絲體開始生長,原絲體呈深綠色,分枝較多,氣生組織和匍匐組織發(fā)育較好;但是當(dāng)光照度達(dá)到4500lx時(shí)就發(fā)生顯著的抑制作用;在低光照度下淺綠色的原絲體變?yōu)楹志G色。在1100~4500lx光照度下均能產(chǎn)生芽,3500lx光照度下的芽數(shù)最多。在1100、2200、3500和4500lx下生長的異毛蘚,其芽開始出現(xiàn)的時(shí)間分別是23、18、15、17d。絲瓜蘚原絲體的培養(yǎng)也呈現(xiàn)出類似的情況。但是,泥炭蘚和其他蘚類在8000lx的光照度下光合作用并不顯示出飽和現(xiàn)象。蘚類放在明暗交替的條件下,生長和發(fā)育都很好(光周期縮短時(shí),生長會減緩)。對于葫蘆蘚來講,光照24h,黑暗4h是最適的。觀察囊果苔(Sphaerocarpus)光形態(tài)建成的結(jié)果表明,此種苔在連續(xù)的白色光照下生長最快,暗處生長不良。在光照條件下黃絲瓜蘚(Pohlianutans)的原絲體本身形成的特殊的形態(tài)分化物質(zhì)反過來可促使其本身的形成,白色光照下也可促進(jìn)芽的形成,紅光效果最佳,藍(lán)光對植株的生長效果最好,但不形成芽,即使在適量蔗糖的條件下也是如此,綠光最不利于生長。因此,在苔蘚植物培養(yǎng)過程中不僅要考慮到光照度和光周期長短,也應(yīng)考慮光波長的影響。2.5環(huán)境對苔蘚生長和生長發(fā)育的影響培養(yǎng)基的pH值對苔蘚植物生長的影響多有報(bào)道。在配培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)充分考慮到苔蘚植物的原始生活環(huán)境。球蒴金發(fā)蘚的最適pH值為5.2。一般情況下,苔蘚的最適pH值范圍在5.0~5.7之間。但對于生長在特殊環(huán)境中的苔蘚來說,其pH受環(huán)境影響較大。張朝暉等報(bào)道短柄紫背苔(Plagiochasmasessillicephalum)孢子萌發(fā)的pH值范圍是6~10,直葉珠蘚(Bartramiaithyphylla)pH值范圍是5~10,反紐蘚(Timmiellaanomala)pH值范圍是6~10。貴州黃果樹喀斯特區(qū)域和云臺山喀斯特林區(qū)生長的苔蘚植物表現(xiàn)出能適應(yīng)堿性環(huán)境,而在較酸環(huán)境條件下(如短柄紫背苔pH值<4,反紐蘚pH值<6,直葉珠蘚pH值<5)孢子則不能正常萌發(fā)。3應(yīng)用和期待3.1生物苔蘚材料中苔蘚的等溫選擇近年來人們對苔蘚組培的注意力絕大部分集中在用來生產(chǎn)和鑒定其中含有的不同生物學(xué)活性物質(zhì)上。苔蘚植物化學(xué)成分的研究已有近百年的歷史,只有近幾十年來,特別是近十年來,這方面的研究才有很快的發(fā)展。人們已對很多苔蘚植物(包括苔類、蘚類、角苔類)的化學(xué)成分作過分析,從苔蘚植物中分離到的次生代謝物質(zhì)中有生物堿、黃酮、萜類、木脂體以及酚類化合物等。就次生物質(zhì)來講,凡是被子植物中有的苔蘚植物中都有。許多苔蘚植物中還含有重要的藥用成分。我國古代書籍中曾有用孔雀草蘚(Maidenhairmoss)的灰促進(jìn)毛發(fā)生長和以金發(fā)蘚作為藥物用于退熱解毒的記載。另外,還有人認(rèn)為苔類中的地錢可以外治瘡毒,內(nèi)治黃疸性肝炎;大葉蘚(Rhodobryumroseuem)和暖地大葉蘚(Rhodobryumgiganteuem)可以治冠心病。國外學(xué)者試圖通過離體培養(yǎng)來獲得大量的苔蘚培養(yǎng)物,以此提取得到有用的次生代謝物質(zhì)。近年來,用組培方法研究苔蘚植物化學(xué)成分的論文很多,其中以日本為最,我國在這方面的研究基本上處于空白狀態(tài)。因此,今后我國這一領(lǐng)域的研究也應(yīng)重視和加強(qiáng)。3.2從苔蘚生長和抗蟲性、耐寒性和耐旱性中的抗逆性研究苔蘚植物對逆性環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)性。許多苔蘚植物既不被動物取食,也不會遭受害蟲襲擊,甚至至今還沒有發(fā)現(xiàn)苔蘚中存有病毒。有些苔蘚植物既可以常年生活在溫度高達(dá)50℃的熱泉周圍,也可以在年平均低于0℃的溫度下生長。一些山地苔蘚在適當(dāng)?shù)乃趾凸庹諚l件下,即使溫度低至-8或-9℃時(shí)仍可以進(jìn)行光合作用,在寒溫帶,一些苔蘚在冬季仍可以生長。不僅如此,苔蘚植物還具有很強(qiáng)的耐旱性,很多種類的苔蘚可以隨著環(huán)境變干將植物體內(nèi)的含水量降到最低,以休眠狀態(tài)生存。Richardson將在黑暗條件下干燥保存了19年的叢本蘚放在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng),結(jié)果仍有生活力。一些泥炭蘚植物經(jīng)干燥處理1周后并不死亡,而且仍能正常生長。從苔蘚植物的抗蟲性、耐寒性和耐旱性可以預(yù)見其內(nèi)部除有抗蟲、抗旱或抗寒的生理特性以外,其內(nèi)部也就是遺傳物質(zhì)上還存有抗逆性的基因。Wood等對從土生墻蘚(Tortularuralis)中大量任意選擇的cDNA或表達(dá)序列靶(expressedsequencetags,ESTs)進(jìn)行分析時(shí),發(fā)現(xiàn)了152個(gè)ESTs,71%與已經(jīng)鑒定的基因無