藥物分析 第十四章維生素類藥物的分析

1第十四章維生素類藥物的分析掌握：VitA、VitB1、VitC、VitE的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及與分析方法間的關(guān)系，專屬鑒別反應(yīng)、主要的含量測定方法與原理。熟悉：VitA、VitB1、VitC、VitE的有關(guān)物質(zhì)、檢查方法與原理。了解：VitD性質(zhì)和分析特點(diǎn)。學(xué)習(xí)要求2

維生素：維持人體正常代謝功能所必須的生物活性物質(zhì)，體內(nèi)不能自行合成40%谷類和麥類主食12%水果18%蔬菜10%肉類、蛋類制品10%乳類制品10%油、脂肪及甜品3VitA、D、E、K等

脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等分類按溶解度4第一節(jié)維生素A的分析VAVA3VA2VA1活性最高5-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:母核：具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯6（一）具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、

具有UV吸收

存在多種立體異構(gòu)化合物全反式VA效價(jià)最高71、溶解性能與三氯甲烷，乙醚，環(huán)己烷，石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。（二）性質(zhì)8VitA2/去氫VA2.不穩(wěn)定性：不飽和雙鍵①易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)VitA3/去水VA9鯨醇(聚合物)10△或有金屬離子存在時(shí)氧化↑②共軛多烯側(cè)鏈易被氧化11環(huán)氧化物VitA醛VitA酸123.紫外特性共軛多烯側(cè)鏈，λmax：325~328nm134.與三氯化銻呈色VitA+SbCl3T.S.→藍(lán)色（不穩(wěn)定）14條件:無水無醇CHCl3二、鑒別試驗(yàn)（一）三氯化銻反應(yīng)（Carr-Price反應(yīng)）15藍(lán)色紫紅16λmax326nm一個(gè)吸收峰λmax350～390nm三個(gè)吸收峰（二）UV17VA在無水乙醇中于326nm波長處有吸收峰發(fā)生脫水反應(yīng)后增加一個(gè)共軛雙鍵，故最大吸收峰向長波位移，出現(xiàn)3個(gè)吸收峰。18USP:顯色劑：磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP:對照品比較法顯色劑：三氯化銻（三）TLC19立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物中間體、副產(chǎn)物溶劑油（一）UV—三點(diǎn)校正法三、含量測定維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸均有紫外吸收20三點(diǎn)校正法：在三個(gè)波長處測定吸光度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸光度A校正值以后，再計(jì)算含量。1.原理（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減?。?）物質(zhì)對光的吸收具有加和性212.波長的選擇

1：VA的max

2、

3

：分別在

1的兩側(cè)各選一點(diǎn)22（1）等波長差法測定對象VitA醋酸酯316328340nm23（2）等吸收比法310325334nm測定對象VitA醇243.測定方法（1）等波長差法

適用于純度高的維生素A醋酸酯

1）方法25第一步：A的選擇判斷是否在326～329nm之間改用皂化法是否

求算2）計(jì)算有很多雜質(zhì)的干擾含量以生物效價(jià)（IU/g）來表示26

計(jì)算與規(guī)定值的差值27判斷差值是否超過規(guī)定值的±0.02有一個(gè)以上超過±0.02無超過±0.02計(jì)算A328（校正）用A328計(jì)算282903%－15%－3%皂化法皂化法30Aiλmax326~329nm是否Ai/A328皂化法與規(guī)定值之差是否超±0.02是否A328校正A328f-15%-3%0+3%皂化法皂化法31注意：

C為混合樣品的濃度32第三步求效價(jià)效價(jià)（IU/g）：每g供試品中所含VitA國際單位數(shù)已知：/IU33換算因子：單位數(shù)值所相當(dāng)于的效價(jià)同法得：維生素A醇換算因子=18303435第四步：求標(biāo)示量％36稀釋倍數(shù)換算因子等波長差法：1900等吸收比法：1830膠丸的平均內(nèi)容物重量稱取的內(nèi)容物重量比色池厚度Amax或Amax（校正）37

VitAD軟膠囊中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為38A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？39A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.009－0.0140+0.023+0.045－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637實(shí)測值規(guī)定值差值40A328(校正)A328(校正)–A328(實(shí)測)A328(實(shí)測)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92%%41=93.9%42適用于維生素A醇雜質(zhì)有干擾時(shí)用此法（2）皂化法

(等吸收比法、6/7A法)43水溶性脂溶性44判斷max是否在323-327nm之間,A300/325≤0.73取未皂化樣品采用色譜法純化后測定計(jì)算是否45判斷A300/A325是否≤0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計(jì)算A325(校正)464703%-3%48三點(diǎn)校正法小結(jié)為何采用三點(diǎn)校正法？波長的選擇原則總結(jié)下表方法測定藥物溶劑測定波長最大波長換算因子等波長差法等吸收比法49Aiλmax326~329nm是否Ai/A328皂化法與規(guī)定值之差是否超±0.02是否A328校正A328f-15%-3%0+3%皂化法皂化法直接測定法：維生素A醋酸酯50Aiλmax323~327nm是否A300/A325色譜法純化后測定與規(guī)定值之差是否超0.73是否A325校正f皂化法：維生素A醇03%-3%色譜法純化后測定51（二）HPLCVitA的含量測定色譜條件：固定相：硅膠流動(dòng)相：正己烷-異丙醇（997：3）檢測波長：325nm52（三）三氯化銻比色法優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速λmax618nm～620nm缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾溫度影響呈色，與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差應(yīng)≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性3藍(lán)色+SbClVitA原理：53氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)HClCl-第二節(jié)維生素B1+54性質(zhì):弱堿性易溶于水應(yīng)用:鑒別

含量測定紫外吸收、S鑒別含量測定結(jié)構(gòu):

氨基嘧啶環(huán)維生素B1噻唑環(huán)季銨鹽酸鹽鑒別551.溶解性易溶于水；水溶液呈酸性一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)2.硫色素反應(yīng)564.與生物堿↓試劑反應(yīng)5.Cl-：呈氯化物的反應(yīng)，用于鑒別3.UV：共軛雙鍵，λmax=246nm57VB1NaOH+鐵氰化鉀+正丁醇強(qiáng)力振搖靜止分層，上面醇層顯強(qiáng)烈藍(lán)色熒光（硫色素）

H＋

OH－熒光消失ChP鑒別試驗(yàn)二、（一）硫色素反應(yīng)※※※5859硫色素–2H(鐵氰化鉀)60（二）沉淀反應(yīng)61S元素反應(yīng)PbS↓黑NaSVitB1Pb(NO3)2NaOH（三）氯化物反應(yīng)（四）硫元素反應(yīng)62三、含量測定（一）非水滴定法溶劑：冰醋酸+醋酐滴定劑：高氯酸終點(diǎn)：電位法并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正63（二）

UV法1.原理：具共軛雙鍵結(jié)構(gòu)適用于：VB1片劑、注射劑溶劑:HCl246nm642.方法：20片W總研成細(xì)粉取W（VB125mg）65=421片劑：3.計(jì)算66注射劑：標(biāo)示量%=67pH值不同，紫外吸收峰也變化pH=2.0(0.1mol/LHCl),λmax=246nm,E=421pH=7.0(磷酸緩沖液),λmax=233nm,E=345

λmax=266nm,E=2554.討論68（三）硫色素?zé)晒夥ㄋ{(lán)色熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀VitB1NaOH1.原理熒光強(qiáng)度與VB1濃度成正比激發(fā)波長365nm發(fā)射波長435nmUSP692.方法氧化試劑：鐵氰化鉀+NaOH對照液：VB1對照品→0.2μg/ml供試液：供試品→0.2μg/ml70測定：1.對照液+氧化試劑+異丁醇

··········+NaOH+······2.供試液+氧化試劑+異丁醇

···········+NaOH+······無水乙醇3.取異丁醇層測熒光強(qiáng)度SdAb713.計(jì)算4.特點(diǎn)（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析72L－抗壞血酸內(nèi)酯烯二醇基**第三節(jié)維生素C73一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.溶解性易溶于水、水溶液呈酸性2.酸性具烯二醇基74一元酸C3-OH的pKa=4.17C2-OH的pKa=11.57酸性較弱酸性較強(qiáng)75L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）3.旋光性**76烯二醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)4.還原性77有活性有活性無活性L-二酮古洛糖酸維生素C去氫抗壞血酸78結(jié)構(gòu)與糖類相似，具糖類的顯色反應(yīng)6.糖的性質(zhì):7.紫外吸收特性：共軛雙鍵5.水解性：內(nèi)酯結(jié)構(gòu)在強(qiáng)堿中水解→酮酸鹽79原理：具還原性，能與氧化劑反應(yīng)二、鑒別試驗(yàn)80（一）與AgNO3反應(yīng)（二）與2,6-二氯靛酚反應(yīng)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色OHˉ81（玫瑰紅色）（無色）82（三）與其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

VitC83（四）糖類的反應(yīng)VCHCl-CO2水解-H2O戊糖糠醛吡咯藍(lán)色△8485戊糖（藍(lán)色）(糠醛)50℃(吡咯)-H2O86（五）

UV

在0.01mol/L的鹽酸中，λmax為243nm（六）TLC

87三、雜質(zhì)檢查（一）溶液的澄清度與顏色檢查內(nèi)酯結(jié)構(gòu)水解-CO2糠醛有色聚合物VC原料、片劑、注射液：分光光度法控制吸收度88（三）草酸原理：草酸+Ca2+→草酸鈣↓

對照法進(jìn)行比較（二）鐵、銅離子的檢查VC原料：原子吸收分光光度法89指示劑：淀粉指示液終點(diǎn)現(xiàn)象？1.原理：具還原性四、含量測定（一）碘量法90

取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O62.方法91（2）酸性環(huán)境d.HAc

（1）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾3.討論92（4）附加劑干擾的排除片劑：滑石粉注射劑：抗氧劑加入：丙酮、甲醛過濾Na2SO3

、NaHSO3

Na2S2O3、Na2S2O593（二）2,6-二氯靛酚滴定法1.原理：維生素C具還原性，可將2,6-二氯靛酚還原為無色的酚亞胺,酸性溶液中2.特點(diǎn)：專屬性強(qiáng)3.適用：USP片劑、口服液

JP注射劑、散劑指示終點(diǎn)？94（三）HPLC口服大劑量維生素C的人體藥動(dòng)學(xué)繆海均，高守紅，范國榮等中國臨床藥學(xué)雜志,2006,15(2):93-951.色譜條件固定相：C18流動(dòng)相：甲醇-0.5%偏磷酸溶液（2.5:97.5）檢測波長：245nm952.穩(wěn)定性考察：不穩(wěn)定，須盡快3.血漿樣品處理：高氯酸、EDTA和DTT4.專屬性考察：空白健康受試者新鮮空白9697結(jié)果:健康志愿者多次口服1g維生素C后,平均穩(wěn)態(tài)血質(zhì)量濃度(12.8±0.92)mg·L-1,

與文獻(xiàn)報(bào)道清除氧自由劑、抗脂質(zhì)過氧化損傷的有效質(zhì)量濃度12.5~50mg·L-1

相符,符合臨床用藥目的98一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)第四節(jié)維生素D甾醇衍生物HO99維生素D3維生素D22223241003.不穩(wěn)定性：多烯，易氧化變質(zhì)一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.性狀：無色針狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末2.溶解性：脂溶性1015.顯色反應(yīng)：開環(huán)的甾體6.紫外吸收4.旋光性：102二、鑒別試驗(yàn)（一）

顯色反應(yīng)醋酐--硫酸反應(yīng)：D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)：橙紅色漸變粉紅甾醇類化合物的共同反應(yīng)103（二）比旋度測定維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無水乙醇無水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°~+107.5°+105°~+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定。104(四)區(qū)別反應(yīng)：以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸，VD2顯紅色，在570nm處有最大吸收，VD3顯黃色，在495nm處有最大吸收。

(三)其他方法：

TLC、HPLC、制備衍生物測熔點(diǎn)、UV、IR105（一）麥角甾醇的檢查（二）前維生素D光照產(chǎn)物的檢查（三）有關(guān)物質(zhì)檢查三、雜質(zhì)檢查106四、含量測定正相高效液相色譜法固定相：硅膠

流動(dòng)相：正己烷-正戊醇（997：3）檢測波長：254nm內(nèi)標(biāo)物：鄰苯二甲酸二甲酯107方法供試品有無VA醇及其他雜質(zhì)干擾有無第一法第二法前VD峰仍受雜質(zhì)干擾第三法108第一法：無維生素A醇及其它雜質(zhì)干擾時(shí)對照品貯備溶液的制備色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：精密度、分離度校正因子的測定含量測定1091．皂化提取：VD+VA

第二法：有維生素A醇及其它雜質(zhì)干擾時(shí)皂化VD+VA醇乙醚提取2．分離：供試液A經(jīng)凈化用色譜柱系統(tǒng)分離，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。

3．含量測定：取供試液B按第一法測定。水洗水層×乙醚層揮干殘?jiān)x心上清：供試液A甲醇110制備供試液：取供試液A，按第二法凈化，水浴加熱，正已烷溶解，得供試液C。制備對照液：對照品儲備液：稀釋、加熱。含量測定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣對照液和供試液，按外標(biāo)法定量。第三法經(jīng)第二法處理后前VD峰仍有雜質(zhì)干擾，僅有維生素D峰可分離111Discussion測定過程中應(yīng)避免VitD的氧化（半暗室、通N2，棕色容器）2.皂化應(yīng)劇烈振搖，水浴溫度≤40℃3.注意色譜系統(tǒng)適用性樣品VitD、前VitD的制備方法112苯并－二氫吡喃醇第五節(jié)維生素E113名稱R1R2相對活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***114天然品

右旋體合成品

消旋體***α－生育酚醋酸酯115苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈易水解紫外吸收脂溶性***旋光性1161、紫外吸收2、水解性——醋酸酯]O[醌型化合物△生育酚H+orOH-VitE雜質(zhì)，需檢查易被氧化一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1173.易被氧化水解→生育酚→醌型118]O[生育紅（一）硝酸反應(yīng)橙紅色75℃15′HNO3VitE生育酚二、鑒別119（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑120（二）三氯化鐵反應(yīng)血紅色配離子VE堿，加熱游離的α-生育酚FeCl3[O]對-生育醌Fe2＋聯(lián)吡啶121生育酚對-生育醌[O]弱氧化劑Fe2++122血紅色123λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中（三）UV124薄層板：硅膠G展開劑：環(huán)己烷-乙醚（4:1）顯色劑：硫酸（105℃，5′）

-生育酚Rf=0.5-生育酚醋酸酯Rf

=0.7-生育醌Rf

=0.9（四）TLC1252.游離生育酚-硫酸鈰滴定法

酸度:檢查游離醋酸

以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積控制。三、雜質(zhì)檢查126例

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml限量？1271283.有關(guān)物質(zhì)GCL的計(jì)算？4.殘留溶劑GC1291.GC特點(diǎn)選擇性好靈敏度高速度快分離效能好(一）GCChP、USP、BP四、含量測定130固定液：填充柱——2%硅酮（OV-17）毛細(xì)管柱——100%二甲基聚硅氧烷柱溫：265℃內(nèi)標(biāo)：正三十二烷

2、色譜條件131（二）HPLCJP色譜條件：固定相：C18流動(dòng)相：甲醇－水（49：1）檢測波長：292nm測定方法：外標(biāo)法132第六節(jié)復(fù)方制劑中多種維生素的分析維生素復(fù)方制劑：脂溶性+水溶性特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)與性質(zhì)差異大易受光線、空氣、溫度和pH的影響133一、離子對HPLC法測定多種維生素例：HPLC測定多種維生素含量水溶性：Vc、VB1、VB2、VB6、煙酰胺脂溶性：VA棕櫚酸酯、VE134色譜條件：色譜柱：ODS流動(dòng)相：A：水溶性維生素(樟腦磺酸+甲醇)

B：脂溶性·············(甲醇)檢測波長：水溶性維生素：272nm

脂溶性·············：280nm135水溶性維生素：內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物：苯酚脂溶性維生素：外標(biāo)法136討論1.離子對試劑的選擇：樟腦磺酸既溶于水，又溶于甲醇易達(dá)到平衡系統(tǒng)清洗方便，柱壽命延長操作費(fèi)用僅為烷基磺酸鹽的1/10~1/201372.抗氧劑：二巰基丙烷磺酸鈉能使被測物質(zhì)保持在穩(wěn)定的初始狀態(tài)，結(jié)果可靠3.特點(diǎn)：快速、簡便、重現(xiàn)性好、分離度和回收率高138維生素復(fù)方制劑：脂溶性+水溶性特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)與性質(zhì)差異大易受光線、空氣、溫度和pH的影響不同流動(dòng)相離子對試劑抗氧劑139二、RP-HPLC同時(shí)測定9種水溶性Vit的含量水樂維他（注射用水溶性維生素）9種水溶性Vit，分離測定困難方法：RP-HPLC梯度洗脫140色譜條件固定相：C18流動(dòng)相A：0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（含0.2%三乙胺）-乙