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文檔簡(jiǎn)介
一、加減法二、Sanger雙脫氧鏈終止法三、Maxam-Gilbert化學(xué)直讀法四、測(cè)序策略五、第二代測(cè)序技術(shù)六、雜交測(cè)序與DNA芯片技術(shù)七、表達(dá)序列標(biāo)簽八、
DNA序列分析第十一章DNA序列測(cè)定和分析第1頁(yè),共81頁(yè)。一、加減法測(cè)序
以待測(cè)DNA為模板,加一同位素標(biāo)記的短鏈引物,在4×dNTP存在下,用DNA聚合酶Ⅰ催化合成各種隨機(jī)長(zhǎng)度的產(chǎn)物。將模板及合成的產(chǎn)物分為“加法組”和“減法組”,加法組和減法組又各分為4組?!凹臃ńM”中的每一小組只加一種dNTP,4組各加不同的dNTP。以加dATP組為例,當(dāng)前面合成的隨機(jī)長(zhǎng)度的DNA下一個(gè)核苷酸該加A時(shí),可以將A加上;如果正好以A結(jié)尾,而下一個(gè)不該加A時(shí),則鏈保持不變;如果不以A結(jié)尾,下一個(gè)又不該加A時(shí),則利用DNA聚合酶Ⅰ的3’→5’外切活性逐個(gè)切除已合成的核苷酸,直到遇到A為止。最終加dATP組的每一條新合成的鏈都是以A結(jié)尾,整個(gè)組中各個(gè)A處結(jié)尾的鏈都有。第2頁(yè),共81頁(yè)。加減法測(cè)序
“減法組”中的每一小組加3種dNTP,4組各缺不同的dNTP。以缺dATP組為例,當(dāng)前面合成的隨機(jī)長(zhǎng)度的DNA下一個(gè)核苷酸該加A時(shí),因無(wú)dATP而不能延伸;如果正好以A結(jié)尾,則將此A切去;如果下一個(gè)不該加A,鏈可以延伸,直到該加A時(shí)停止延伸。最終缺dATP組的每一條新合成的鏈都是在A前一個(gè)核苷酸處結(jié)尾,整個(gè)組中各個(gè)A前處結(jié)尾的鏈都有。
引物是同位素標(biāo)記了的,通過(guò)電泳分離這8個(gè)組的產(chǎn)物,顯帶后即可讀出待測(cè)序模板的序列。第3頁(yè),共81頁(yè)。加減法測(cè)序
加dATP組開始合成的隨機(jī)長(zhǎng)度片段減dATP組第4頁(yè),共81頁(yè)。二、雙脫氧鏈終止法
這是一種基于DNA合成的方法。以被測(cè)序列的單鏈DNA為模板,分成4個(gè)反應(yīng)體系,每個(gè)反應(yīng)體系中加有Klenow片段(或測(cè)序酶)、引物、4種dNTP(其中一種或兩種dNTP帶有放射性標(biāo)記)。將4種2’,3’-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)分別加到4個(gè)反應(yīng)體系中去,進(jìn)行聚合反應(yīng)。當(dāng)新合成的DNA鏈上加的是dNTP時(shí),新鏈可以繼續(xù)延伸;當(dāng)新合成的鏈上加的是ddNTP時(shí),因ddNTP沒(méi)有3’羥基,新鏈不能繼續(xù)延伸,合成終止。這樣在每一個(gè)反應(yīng)體系中,產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不等的新鏈,它們的共同特點(diǎn)是以該體系中所加的ddNTP為3’末端。第5頁(yè),共81頁(yè)。雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理
反應(yīng)結(jié)束后將4個(gè)反應(yīng)體系中的產(chǎn)物分別加到1個(gè)電泳加樣槽中跑電泳。采用高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,可分辨出一個(gè)核苷酸的差別。從電泳結(jié)果的條帶可以直接讀出被測(cè)序DNA的序列。第6頁(yè),共81頁(yè)。Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序第7頁(yè),共81頁(yè)。雙脫氧鏈終止法測(cè)序注意事項(xiàng)在反應(yīng)體系中要注意所加ddNTP與相應(yīng)dNTP的比例。不同的DNA聚合酶對(duì)ddNTP和dNTP的親和力不同,應(yīng)先固定dNTP的濃度,改變ddNTP的濃度作預(yù)備實(shí)驗(yàn),以求得二者的最佳比例。第8頁(yè),共81頁(yè)。M13作載體的Sanger測(cè)序過(guò)程第9頁(yè),共81頁(yè)。雙向測(cè)序示意圖一第10頁(yè),共81頁(yè)。雙向測(cè)序示意圖二第11頁(yè),共81頁(yè)。雙脫氧鏈激光熒光法
引物分別用4種熒光染料標(biāo)記(發(fā)射光的顏色不同),用雙脫氧鏈終止法,不同熒光染料標(biāo)記的引物與不同的ddNTP配合使用。反應(yīng)完后混合點(diǎn)樣于一個(gè)電泳點(diǎn)樣槽中,在凝膠的底部用激光照射凝膠(檢測(cè)器),電泳的區(qū)帶依次通過(guò)檢測(cè)器,激發(fā)熒光染料分別發(fā)出4種不同顏色的光,按顏色順序即可讀出序列。第12頁(yè),共81頁(yè)。自動(dòng)化測(cè)序的輸出信號(hào)第13頁(yè),共81頁(yè)。三、Maxam-Gilbert化學(xué)直讀法
這是一種基于DNA降解的方法。此法的原理是首先將待測(cè)序的DNA片段一端用放射性標(biāo)記,然后使DNA鏈在特定堿基處斷裂??刂茥l件使每個(gè)DNA分子只發(fā)生一處斷裂,就可以得到一系列只差一個(gè)核苷酸的DNA片段,跑電泳后可得出序列。第14頁(yè),共81頁(yè)。Maxam-Gilbert化學(xué)直讀法
在特定堿基處斷裂的反應(yīng)可分為兩個(gè)步驟:①對(duì)特定堿基(或特定類型的堿基)進(jìn)行化學(xué)修飾;②使修飾了的堿基從糖環(huán)上脫落,脫堿基的核糖3’和5’磷酸二酯鍵斷裂。
具體操作是分成4組進(jìn)行不同的化學(xué)反應(yīng),每組斷裂在不同種類的核苷酸處。第15頁(yè),共81頁(yè)。Maxam-Gilbert法測(cè)序第16頁(yè),共81頁(yè)。Maxam-Gilbert化學(xué)直讀法的反應(yīng)
第1組只在G處發(fā)生斷裂。在pH8.0,用硫酸二甲酯可以使鳥嘌呤的N7甲基化(在一定條件下腺嘌呤不易甲基化),甲基化鳥嘌呤不穩(wěn)定,容易脫嘌呤。
第2組只在G+A(嘌呤)處發(fā)生斷裂。在pH2.0,哌啶甲酸可以使嘌呤環(huán)的N原子質(zhì)子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤。
第3組只在C+T處發(fā)生斷裂。用肼打開嘧啶環(huán),被打開的嘧啶環(huán)會(huì)重新環(huán)化成五元環(huán),易脫落。
第4組只在C處發(fā)生斷裂。如果在肼解時(shí)存在1.5mol/LNaCl,則抑制肼和T的反應(yīng),只修飾C處。以上4組反應(yīng)后,用熱哌啶溶液(90℃,1mol/L,溶于水)處理,可以在經(jīng)化學(xué)修飾位點(diǎn)的3’和5’側(cè)斷裂磷酸二酯鍵。第17頁(yè),共81頁(yè)。Maxam-Gilbert法測(cè)序原理第18頁(yè),共81頁(yè)。A>C的反應(yīng)
還有一種反應(yīng)(A>C),必要時(shí)可用來(lái)參考。在90℃下,用1.2mol/LNaOH處理,可使A位點(diǎn)發(fā)生劇烈的斷裂反應(yīng),而C位點(diǎn)的斷裂反應(yīng)較微弱。第19頁(yè),共81頁(yè)。四、測(cè)序策略
鳥槍法又稱隨機(jī)法,它是先將大片段DNA經(jīng)酶切或超聲處理,切割成適合測(cè)序大小的片段(如500~800bp),然后亞克隆到M13載體上,得到單鏈DNA后測(cè)序,再根據(jù)重疊的部分推測(cè)出整個(gè)大片段的序列。
用M13mp8和M13mp9可以從兩個(gè)方向測(cè)序。鳥槍法第20頁(yè),共81頁(yè)。鳥槍法第21頁(yè),共81頁(yè)。引物步移法
將待測(cè)序片段克隆到M13單鏈?zhǔn)删w載體上,用與克隆位點(diǎn)附近的已知序列互補(bǔ)的DNA作引物(通用引物),測(cè)出一段序列;然后以測(cè)出序列的末端序列為標(biāo)準(zhǔn)合成引物,再往前測(cè)序,直到完成。
第22頁(yè),共81頁(yè)。引物步移法第23頁(yè),共81頁(yè)。五、第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)的核心思想是邊合成(或連接)邊測(cè)序(sequencingbysynthesisorligation,SBS&SbL)。即生成新DNA互補(bǔ)鏈時(shí),要么加入的dNTP通過(guò)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光,要么直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP或半簡(jiǎn)并引物,在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí),釋放出熒光信號(hào)。通過(guò)捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值,獲得互補(bǔ)鏈序列信息。第二代測(cè)序法徹底廢棄了電泳步驟,為快速、大規(guī)模測(cè)序提供了新的思路和方法。第24頁(yè),共81頁(yè)。
1.Roche(454)GSFLXsequencer
Roche公司收購(gòu)454公司的測(cè)序儀并經(jīng)改造升級(jí),該測(cè)序儀最早的商業(yè)化產(chǎn)品于2004年推出。454測(cè)序儀測(cè)序步驟為:(1)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。(2)乳滴PCR。(3)PTP載樣。(4)測(cè)序。
第25頁(yè),共81頁(yè)。(1)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)將待測(cè)樣品的DNA用物理方法打成300~800bp的片段,然后在片段兩端分別加上錨定接頭。選擇出兩端分別帶有A、B接頭的建庫(kù)片段。(如何選?)sstDNA:?jiǎn)捂溎0錎NA(single-strandedtemplateDNA)第26頁(yè),共81頁(yè)。(2)乳滴PCR將帶有接頭的成百上千條DNA片段,分別結(jié)合到一個(gè)磁珠上(通過(guò)接頭B上標(biāo)記的生物素結(jié)合到磁珠上的鏈霉抗生物素上),乳化形成乳滴,每個(gè)乳滴中含有一個(gè)磁珠,在這個(gè)小滴內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增。
第27頁(yè),共81頁(yè)。(2)乳滴PCR由于磁珠表面布滿了上百萬(wàn)條與文庫(kù)構(gòu)建時(shí)加入的接頭互補(bǔ)的寡核苷酸序列,待測(cè)樣品在磁珠上經(jīng)過(guò)PCR,每個(gè)磁珠表面將獲得大于一百萬(wàn)倍的原始DNA片段的拷貝,以達(dá)到測(cè)序反應(yīng)所需的檢測(cè)信號(hào)值。第28頁(yè),共81頁(yè)。(3)PicoTiterPlate載樣
孔徑:平均44μm每孔含一個(gè)sstDNA擴(kuò)增后的單克隆的磁珠可以平行讀取200,000個(gè)讀數(shù)孔中填的小紅顆粒為固定化酶(ATP硫酸化酶和熒光素酶)第29頁(yè),共81頁(yè)。(4)測(cè)序Klenow酶
第30頁(yè),共81頁(yè)。焦磷酸測(cè)序反應(yīng)第31頁(yè),共81頁(yè)。焦磷酸測(cè)序反應(yīng)將固定有焦磷酸測(cè)序反應(yīng)所需酶的微磁珠加入PTP孔內(nèi),每次加一種dNTP,在發(fā)生了延伸相應(yīng)dNTP反應(yīng)的孔中發(fā)出光,光的強(qiáng)度與延伸的相應(yīng)dNTP的數(shù)量成正比,這樣可以記錄連續(xù)延伸多個(gè)某種dNTP的情況。檢測(cè)并記錄此光信號(hào)。加入三磷酸腺苷雙磷酸酶清除掉剩余的dNTP和ATP后,再加入另一種dNTP,進(jìn)行第二輪檢測(cè)。溶液一遍一遍地通過(guò)PTP板,根據(jù)各孔光信號(hào)出現(xiàn)的順序確定各孔待測(cè)DNA的序列。
第32頁(yè),共81頁(yè)。GSFLX系統(tǒng)的特點(diǎn)(1)一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)7.5個(gè)小時(shí),獲得超過(guò)1Mb的堿基數(shù)據(jù);(2)單個(gè)序列的讀長(zhǎng)更長(zhǎng),平均可達(dá)到200~300個(gè)堿基左右;(3)通量更高,每個(gè)反應(yīng)可以得到超過(guò)40萬(wàn)個(gè)序列讀長(zhǎng),成本大大降低;(4)讀長(zhǎng)超過(guò)200bp時(shí),單一讀長(zhǎng)的準(zhǔn)確性可以超過(guò)99.5%;(5)測(cè)序結(jié)果一致性超過(guò)99.99%;第33頁(yè),共81頁(yè)。2.
Solexa
Sequencer
2006年Illumina公司以高達(dá)6.15億美元的價(jià)格收購(gòu)Solexa公司,并將Solexa測(cè)序儀命名為Illuminagenomeanalyzer。Solexa測(cè)序儀的測(cè)序原理是“邊合成邊測(cè)序”,可以同時(shí)在DNA擴(kuò)增表面讀取數(shù)千萬(wàn)個(gè)32~40bp長(zhǎng)的片段。
第34頁(yè),共81頁(yè)。(1)樣品制備、附著、橋型擴(kuò)增第35頁(yè),共81頁(yè)。橋型擴(kuò)增成簇第36頁(yè),共81頁(yè)。(2)合成測(cè)序第37頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序反應(yīng)
測(cè)序時(shí),加入引物、DNA聚合酶及4種3’羥基修飾的dNTP(3’-O-azidomethylgroup)和4種帶熒光標(biāo)記基團(tuán)的ddNTP(2’,3’-雙脫氧核苷酸)。對(duì)于某一簇模板來(lái)說(shuō),多數(shù)引物上加的是3’羥基修飾的dNTP,少數(shù)引物上加的是帶熒光標(biāo)記基團(tuán)的ddNTP。激發(fā)此熒光標(biāo)記基團(tuán)發(fā)出某色光(紅、黃、藍(lán)、綠之一),并記錄,可知這個(gè)核苷酸是哪種核苷酸。加入三(2-羥乙基)膦,脫去dNTP3’羥基上的修飾基團(tuán)和ddNTP上的熒光標(biāo)記基團(tuán)。dNTP的3’羥基可繼續(xù)延伸合成下一個(gè)核苷酸,脫去ddNTP的熒光基團(tuán)以避免干擾下一個(gè)核苷酸的檢測(cè)。第38頁(yè),共81頁(yè)。(3)結(jié)果分析8道同步測(cè)序第39頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序時(shí)加的第一類核苷酸3′-O-azidomethylgroup
第40頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序時(shí)加的第二類核苷酸ddCTPddUTPddATPddGTP第41頁(yè),共81頁(yè)。Solexa技術(shù)的特點(diǎn)目前Solexa測(cè)序的平均讀長(zhǎng)在32~40bp之間,一般地,一個(gè)Run獲得的數(shù)據(jù)量大于1Gb,運(yùn)行一個(gè)Run需要3天時(shí)間。Solexa測(cè)序儀最大的優(yōu)勢(shì)在于測(cè)序價(jià)格低廉,數(shù)據(jù)讀取量大。相同數(shù)據(jù)量的情況下,Solexa測(cè)序費(fèi)用是454測(cè)序費(fèi)用的1/10。但是,由于序列讀長(zhǎng)較短,去除接頭序列后,有效讀長(zhǎng)更短,因此測(cè)序后數(shù)據(jù)的裝配需要有強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力作為支撐。
第42頁(yè),共81頁(yè)。3.
SOLiDsequencer
SOLiDsequencer與其他第二代測(cè)序儀不同的是,它不是利用DNA聚合酶在合成過(guò)程中讀取序列,而是利用DNA連接酶在連接過(guò)程讀取序列。SOLiD測(cè)序的基本流程為:(1)制備測(cè)序文庫(kù)。(2)乳滴PCR。(3)邊連接邊測(cè)序。第43頁(yè),共81頁(yè)。邊連接邊測(cè)序法測(cè)序反應(yīng)開始于通用測(cè)序引物P1的退火,使得通用引物與模板雜交,同時(shí)測(cè)序儀自動(dòng)利用DNA連接酶將與待測(cè)片段匹配的半簡(jiǎn)并引物連接到通用引物的3’末端。根據(jù)堿基的不同組合,在末端標(biāo)記不同的熒光素。當(dāng)簡(jiǎn)并引物中的一種與引物連接后,測(cè)定其熒光顏色,通過(guò)捕獲熒光,可以確定第4位和第5位堿基的序列。用化學(xué)方法將第6位到第8位的堿基切除,再啟動(dòng)下一輪連接。每次連接切除后保留5個(gè)核苷酸。SOLiD測(cè)序的平均讀長(zhǎng)在25~35bp之間,而由于每次讀序都是2個(gè)堿基,同時(shí)每個(gè)堿基被讀的次數(shù)是2次,因此,這種方法又被稱為“兩堿基讀序”
第44頁(yè),共81頁(yè)。(1)制備DNA片段文庫(kù)(兩種文庫(kù))第45頁(yè),共81頁(yè)。制備matepair文庫(kù)第46頁(yè),共81頁(yè)。制備matepair文庫(kù)第47頁(yè),共81頁(yè)。(2)乳滴PCR第48頁(yè),共81頁(yè)。磁珠固定3’末端修飾第49頁(yè),共81頁(yè)。(3)邊連接邊測(cè)序Spatialseparationamongdye,ligation&cleavagesites簡(jiǎn)并堿基通用堿基探針的性質(zhì)第50頁(yè),共81頁(yè)。第一輪連接反應(yīng)DNA連接酶通用測(cè)序引物四色探針,每色探針共有256種序列,每色探針的4,5位序列有4種。第51頁(yè),共81頁(yè)。檢測(cè)熒光、切去熒光基團(tuán)第52頁(yè),共81頁(yè)。第二輪連接反應(yīng)DNA連接酶第53頁(yè),共81頁(yè)。檢測(cè)熒光、切去熒光基團(tuán)共進(jìn)行5輪連接反應(yīng)第54頁(yè),共81頁(yè)。換后移一位的引物再次連接1911,1210,11第55頁(yè),共81頁(yè)。用兩套引物測(cè)定matepair文庫(kù)第56頁(yè),共81頁(yè)。熒光顏色與序列的關(guān)系第57頁(yè),共81頁(yè)。SOLiDsequencer的特點(diǎn)
SOLiDsequencer的主要優(yōu)勢(shì)在于具有很高的序列讀取精確度和數(shù)據(jù)輸出量,它的序列讀取精確率是其他新一代測(cè)序儀的10倍,每一個(gè)run需要大約5天,每輪運(yùn)行可以產(chǎn)生約3~4Gb的數(shù)據(jù)。而相同數(shù)據(jù)量的測(cè)序價(jià)格略低于Solexa測(cè)序的價(jià)格。SOLiD的測(cè)序采用雙堿基編碼法進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序過(guò)程中,對(duì)每個(gè)堿基分析判讀兩遍,能夠在序列測(cè)定過(guò)程中過(guò)濾原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤,提供內(nèi)部錯(cuò)誤校正。同樣地,由于序列讀長(zhǎng)較短,測(cè)序后數(shù)據(jù)的裝配需要有堅(jiān)實(shí)的生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)。第58頁(yè),共81頁(yè)。4.HeliScopeSequencer
Helicos公司開發(fā)的HeliScopeSequencer相對(duì)較晚才出現(xiàn),直到2008年2月才收到第一個(gè)訂單。該測(cè)序儀的原理是“單分子測(cè)序”,它可以通過(guò)合成互補(bǔ)鏈技術(shù)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA片段進(jìn)行測(cè)序。影響其發(fā)展的關(guān)鍵因素在于對(duì)測(cè)序過(guò)程中的讀出長(zhǎng)度一直處于很低的水平。經(jīng)過(guò)眾多科學(xué)家的不懈努力,2006年終于在讀出長(zhǎng)度上取得突破性進(jìn)展,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步對(duì)其體系的優(yōu)化,推出了這種全新的HeliScope單分子測(cè)序方法。
第59頁(yè),共81頁(yè)。HeliScope測(cè)序的基本流程(1)利用物理方法將待測(cè)樣品打斷,在待測(cè)DNA樣品的3‘末端加上Poly(A),利用末端轉(zhuǎn)移酶在接頭末端加上Cy3熒光標(biāo)記。(2)將已加PolyA的待測(cè)DNA樣品加到一平板表面,平板表面固定有50個(gè)T的寡聚核苷酸鏈,通過(guò)退火,待測(cè)DNA樣品可以被錨定在表面。(3)通過(guò)熒光成像系統(tǒng),對(duì)平板表面進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè),結(jié)合上待測(cè)DNA片段的位點(diǎn)將發(fā)出熒光信號(hào),記錄這些位點(diǎn)以方便后續(xù)的測(cè)序工作。第60頁(yè),共81頁(yè)。HeliScope測(cè)序的基本流程(4)在平板表面加入堿基被Cy5熒光標(biāo)記的dCTP(C/T/A/G依次加入)和DNA聚合酶的混合溶液,接著進(jìn)行洗脫,熒光成像,監(jiān)測(cè)上述位點(diǎn)的熒光信號(hào)以確定哪些位點(diǎn)結(jié)合上了堿基C,從而判斷該處的待測(cè)DNA堿基為G。(5)化學(xué)裂解Cy5與堿基的連接以釋放熒光標(biāo)記。(6)加入下一個(gè)堿基被Cy5熒光標(biāo)記的核苷酸和DNA聚合酶的混合溶液。
第61頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序步驟制備模板、加尾和熒光標(biāo)記退火結(jié)合到平板表面平板第62頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序步驟熒光定位加第一個(gè)核苷酸,熒光定位平板平板第63頁(yè),共81頁(yè)。測(cè)序步驟除去第一個(gè)核苷酸的熒光基團(tuán)加第二個(gè)核苷酸,熒光定位平板平板第64頁(yè),共81頁(yè)。記錄各位點(diǎn)的發(fā)光情況第65頁(yè),共81頁(yè)。兩遍測(cè)序第66頁(yè),共81頁(yè)。HeliScope測(cè)序的特點(diǎn)目前,HeliScope測(cè)序法的平均讀長(zhǎng)在25bp左右,最長(zhǎng)可達(dá)到30bp。在第一輪測(cè)序結(jié)束后,通過(guò)加熱解鏈,可以對(duì)同一DNA模板分子進(jìn)行第二遍測(cè)序(two-pass),其錯(cuò)誤率可以控制在0.2%~1%之間,每小時(shí)可獲得大約25~90Mb的數(shù)據(jù)。HeliScope的最大的優(yōu)勢(shì)在于它不需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增模板。它的熒光捕獲系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度非常高,能檢測(cè)一個(gè)單分子合成所釋放的熒光信號(hào)。由于不需經(jīng)過(guò)預(yù)擴(kuò)增,它可以避免很多因?yàn)镻CR擴(kuò)增而引入的不確定因素,而且可以通過(guò)二輪測(cè)序來(lái)提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。同時(shí)HeliScope測(cè)序所消耗的試劑量也會(huì)大大降低,因此它的測(cè)序成本是目前所有新一代測(cè)序儀中最低的。
第67頁(yè),共81頁(yè)。單分子測(cè)序的進(jìn)展
HelicosBioSciencesannouncedimprovementsintheperformanceoftheHelicosGeneticAnalysisSystem.Withtheseimprovements,thesystemisgenerating20to30Gigabases(Gb)ofhigh-qualitysequencedataperrun,anoutputequivalenttothesequencingof7to10humangenomesperrun.Thisnewperformancepointgenerateshigh-qualitydataatarateof100to150Megabases(MB)perhour.ThesedataareavailableontheHeliSphereTechnologyCenter,thecompany'sopenaccessWebsiteshowcasingsinglemoleculesequencedataandopensourceinformaticstools.第68頁(yè),共81頁(yè)。IonTorrent半導(dǎo)體測(cè)序
IonTorrent技術(shù)通過(guò)專有的大規(guī)模并行半導(dǎo)體感應(yīng)器,對(duì)DNA復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的離子流,實(shí)現(xiàn)直接和實(shí)時(shí)的檢測(cè)。當(dāng)試劑通過(guò)集成的流體通路進(jìn)入IonTorrent半導(dǎo)體芯片中,密布于芯片上的反應(yīng)孔立即成為上百萬(wàn)個(gè)微反應(yīng)體系。這種獨(dú)特的流體體系、微體系機(jī)械設(shè)計(jì)和半導(dǎo)體的技術(shù)組合,得以快速直接地得出DNA測(cè)序結(jié)果,得到大量高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。IonTorrent半導(dǎo)體芯片第69頁(yè),共81頁(yè)。芯片局部放大圖第70頁(yè),共81頁(yè)。六、雜交測(cè)序與DNA芯片技術(shù)
雜交測(cè)序(sequencingbyhybridization,SBH)是一種基于DNA雜交的測(cè)序方法,它的特點(diǎn)是迅速。首先人工合成各種8(或n)-mer寡核苷酸,然后將每一種寡核苷酸按一定規(guī)律固定在特殊材質(zhì)芯片(玻璃或凝膠)表面的一個(gè)位點(diǎn)上,一共有48(65536)(或4n)個(gè)位點(diǎn)共處于一個(gè)芯片,成為指甲大小的DNA芯片(DNAchip)。這些寡核苷酸也可以在芯片上就位合成。
第71頁(yè),共81頁(yè)。雜交測(cè)序的過(guò)程讓熒光標(biāo)記的待測(cè)單鏈DNA與芯片上的寡核苷酸(即固定的探針)雜交,然后在
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