稀土金屬元素標(biāo)記行為考察

稀土金屬元素標(biāo)記行為考察林虹君1馮流星2張愛紅3韋超2王軍2王昕3張養(yǎng)軍1蔡耘1錢小紅*11（蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室，北京蛋白質(zhì)組研究中心,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京，102206）

2（中國計量科學(xué)研究院，北京，100013）3（防化學(xué)院，北京，102205）摘要稀土金屬元素因其與雙功能試劑螯合效率高、對肽段的反相色譜行為和質(zhì)譜的離子化效率影響小、檢測背景低以及過量金屬離子在檢測時不會產(chǎn)生干擾等優(yōu)點，近年來已經(jīng)在生物標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜定量分析研究領(lǐng)域引起了關(guān)注。本研究選取稀土金屬中單同位素元素鋱（Tb）、釔（Y）、銩（Tm）、欽（Ho）和镥（Lu）5種元素，通過雙功能試劑二乙三胺五乙酸雙酸酐（DTPA雙酸酐）對合成肽段及蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物標(biāo)記的過程進(jìn)行了研究，包括對標(biāo)記條件進(jìn)行了優(yōu)化以及對該質(zhì)量標(biāo)簽的色譜行為和共洗脫、標(biāo)記穩(wěn)定性、離子交換、動態(tài)范圍、質(zhì)譜檢測限等現(xiàn)象進(jìn)行了考察，結(jié)果表明銩和鈥兩元素結(jié)合效率最高，分別達(dá)到了92.5%和89.9%；穩(wěn)定性考察結(jié)果表明質(zhì)量標(biāo)簽在4°C放置一周仍有95%被檢測到，若將標(biāo)記好的標(biāo)簽用于定量研究，則放置時間不能超過兩周；多金屬標(biāo)記質(zhì)量標(biāo)簽可以共洗脫；在兩種金屬濃度差不超過6倍時，由離子抑制帶來的影響較小。離子交換結(jié)果表明，只有很少部分發(fā)生了離子交換，對標(biāo)記實驗沒有影響。關(guān)鍵詞稀土金屬，質(zhì)量標(biāo)簽，基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜1引言隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，蛋白質(zhì)組學(xué)由定性表達(dá)譜向定量研究發(fā)展，而新的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法的研究是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、驗證和確認(rèn)的重要支撐。蛋白質(zhì)組定量方法包括基于標(biāo)記和非標(biāo)記結(jié)合生物質(zhì)譜的方法，而基于非標(biāo)記的質(zhì)譜定量方法是半定量方法，限制了其在定量研究中的應(yīng)用，因此我們的研究工作仍然側(cè)重于基于標(biāo)記的質(zhì)譜定量方法。蛋白質(zhì)標(biāo)記方法主要有化學(xué)標(biāo)記和生物標(biāo)記，化學(xué)標(biāo)記包括：乙?；瘶?biāo)記、同位素標(biāo)記⑴和ITRAQ標(biāo)記Z3］等；生物標(biāo)記包括：SILAC標(biāo)記⑷等。另外，酶促標(biāo)記（如180【5］標(biāo)記）是常用的標(biāo)記方法，但其穩(wěn)定性和標(biāo)記完全性還存在問題，因此尋求其它標(biāo)記方法仍是定量研究的一個重要內(nèi)容。Meares研究組［6］在2004年以化學(xué)性質(zhì)很相近的稀土金屬元素為質(zhì)量標(biāo)簽，提出了針對蛋白質(zhì)巰基標(biāo)記的新方法“元素標(biāo)記親和標(biāo)簽”（Element-codedaffinitytags,ECAT'劉等⑺在2006年將稀土金屬通過雙功能試劑與標(biāo)準(zhǔn)肽段結(jié)合，實現(xiàn)了基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)相對定量。稀土金屬元素用于蛋白質(zhì)標(biāo)記具有以下優(yōu)點：各金屬元素物理化學(xué)性質(zhì)非常相近，可以組成多種組合；與同位素試劑相比，稀土金屬價格便宜［8］；稀土金屬元素之間分子量相差較大，可以有效避免同位素質(zhì)譜峰重疊；與無機(jī)質(zhì)譜結(jié)合對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，具有檢測靈敏度高，定量動態(tài)范圍大等特點［9］。該方法的缺點是：標(biāo)記效率低，對于兩種以上的不同金屬的標(biāo)記的可能性尚未研究。本研究選用稀土金屬鋱（Tb）、釔（Y）［io］、銩（Tm）、欽（Ho）和镥（Lu）M作為質(zhì)量標(biāo)簽，首先對標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化，然后對標(biāo)記效率、色譜行為、穩(wěn)定性以及離子交換等指標(biāo)分別進(jìn)行了考察，結(jié)果表明將稀土金屬標(biāo)記方法用于蛋白質(zhì)組相對定量時需要對稀土元素進(jìn)行仔細(xì)選擇和配對。實驗部分2.1儀器和試劑基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（4800MALDITOF/TOFAnalyzer,美國ABSCIEX公司）；真空離心干燥機(jī)（SC100ASpeedvacPlusMODULYOD-230,美國ThermoSavant公司）；高效液相色譜儀（P230，大連依利特分析儀器有限公司）；純水系統(tǒng)（MilliQ,MerckMillipore公司）。二乙三胺五乙酸雙酸酐（diethylenetriamine-N,N,N',N",N"',-pentaaceticaciddianhydride，DTPA雙酸酐），四氮雜環(huán)十二烷四乙酸（DOTA）：日本DOJINDO公司；三乙二胺碳酸鹽（Triethylammoniumbicarbonate,TEAB）：美國Sigma公司；乙腈（HPLC級）：美國J.T.Baker公司；乙酸、醋酸銨均為分析純：北京化工廠；TbCl3、YCl3、TmCl3、HoCl3和LuCl3均為分析純：中國計量科學(xué)研究院。2.2實驗方法2.2.1樣品制備TEAB：0.05M，pH7.0；醋酸銨：0.1M，pH6.0。2.2.2質(zhì)譜分析對樣品分析時，取5yL處理好的樣本溶液，與飽和的基質(zhì)溶液（5mg/mLCHCA,溶于含0.1%TFA的50%乙腈中）按照1:9的比例混合，取0.6吐點靶，在空氣中揮發(fā)干燥，在基質(zhì)輔助激光解析電離/飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)采集條件：正離子反射模式（MS-1KV）,加速電壓20KV,掃描范圍m/z700?1600，譜圖采集軟件為4000series，累計采集1500~2000次。根據(jù)同一肽段與金屬元素標(biāo)記后與標(biāo)記前質(zhì)譜峰峰高的比值來評估反應(yīng)進(jìn)行的完全程度，從而確定標(biāo)記反應(yīng)的最佳條件。用標(biāo)準(zhǔn)多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜儀的外標(biāo)校正。結(jié)果與討論3.1標(biāo)記元素的選擇選擇金屬元素時，首先考慮用單同位素金屬作為標(biāo)記元素，目的是為降低樣品質(zhì)譜圖的復(fù)雜程度。稀土金屬元素中有8種是單同位素（見表1），按照兩兩配對，能夠形成28種組合，其質(zhì)量差從1到86Da不等，按照差值不小于4Da的原則，共有25種有效組合。其次要考慮的是金屬元素的螯合常數(shù)要足夠大。表2為選用的將金屬元素和肽段連接起來的雙功能試劑為DTPA雙酸酐時的各金屬與該試劑的螯合常數(shù)[12]，如此大的螯合常數(shù)可以確保金屬質(zhì)量標(biāo)簽的穩(wěn)定性。三是不同金屬元素的螯合常數(shù)相差不易過大。差值過大則意味著兩者在同一體系中時，容易發(fā)生金屬離子的交換，因此所選元素的螯合常數(shù)相差以不超過1為宜。據(jù)此條件，我們選擇89Y、】59Tb、】65Ho、】69Tm、和^Lu作為研究對象對質(zhì)量標(biāo)簽的穩(wěn)定性、色譜和質(zhì)譜等行為進(jìn)行了考察。表1稀土元素中的單同位素元素Table1monoisotopicelementsinlanthanideelementsElement89Y139La140Ce141Pr159Tb165Ho169Tm175LU89Y50515270768086139La1220263036140Ce119252935141Pb61016165Ho410169Tm6175Lu表28種單同位素元素與DTPA雙酸酹的螯合常數(shù)Table2TheconstantsofeightsingleisotopeelementschelatingWthDTPAdianhydrde元素名稱89Y139La140Ce141Pr159Tb165Ho169Tm175Lu螯合常數(shù)22.0519.4820.5021.0722.7122.7822.7222.443.2標(biāo)記條件優(yōu)化稀土金屬標(biāo)記方法是經(jīng)由雙功能試劑將稀土金屬元素和目標(biāo)肽段連接起來，通過對該質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記肽段定量測定達(dá)到對蛋白質(zhì)定量檢測的目的。由于雙酸酐在水溶液中極易水解，所以其標(biāo)記要嚴(yán)格遵循一定的反應(yīng)順序且要迅速完成。首先選用標(biāo)準(zhǔn)肽段Kemptide進(jìn)行標(biāo)記條件優(yōu)化。具體步驟為：首先將標(biāo)準(zhǔn)肽段Kemptide（0.14mg）和DTPA雙酸酐（3.26mg）固體加入到TEAB溶液（320此）中，劇烈渦振1min,離心樣品至管底，室溫放置0.5h。真空離心干燥；然后用醋酸銨緩沖液重新溶解凍干的樣品，再加入金屬元素，于37°C水浴2h，為了提高金屬元素的標(biāo)記效率，加入金屬離子的摩爾數(shù)為DTPA雙酸酐的5倍。將反應(yīng)

產(chǎn)物按1:9與基質(zhì)混合，取0.6“L點靶，進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。如質(zhì)譜圖1所示，肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合后的譜圖中未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)肽段LRRASLG的質(zhì)譜峰（771.9106）,而出現(xiàn)較強(qiáng)的肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合后的質(zhì)譜峰（1147.4558）,表明肽段與DTPA雙酸酐結(jié)合效率達(dá)到了100%。100]80-100]80-?盒6035=40-「20：0——7004.0E*41600胛39礙6[97評級2楓』2讐56 ,1600880 1060 1240 1420Mass(m/z)圖1標(biāo)準(zhǔn)肽段(LRRASLG)與DTPA雙酸酐結(jié)合質(zhì)譜圖Fig.1TheMSspectraofstandardpeptide(LRRASLG)combinedwithDTPAdianhydride在此基礎(chǔ)上，考察雙酸酐試劑與金屬元素的標(biāo)記效率。由于雙酸酐試劑與金屬元素絡(luò)和效率不僅與螯合常數(shù)有關(guān)，還與體系溫度、反應(yīng)時間、緩沖液pH以及金屬過量倍數(shù)有關(guān)，因此，為了得到最佳螯合率，選擇金屬銩和欽對以上影響因素分別進(jìn)行了考察。如圖2a所示，通過對反應(yīng)溫度25°C、37°C、60°C和80C考察，結(jié)果表明在37C時標(biāo)記效率最高，達(dá)到71%；圖2b中，通過對pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5進(jìn)行考察，在pH6時螯合率最高，達(dá)到76%；圖2c中，通過對反應(yīng)時間0.5h、1h、2h、3h、5h和過夜進(jìn)行考察，在反應(yīng)時間2h時螯合率最高，達(dá)到86%；圖2d中，通過對金屬離子與DTPA雙酸酐的摩爾比例為1倍、2倍、3倍、5倍和10倍進(jìn)行考察，在兩者比例為5倍時，螯合率最高，達(dá)到90%。25 37 60 80溫度(C)5.0 5.56.0 6.57.0 7.5反應(yīng)時間（h）0.5 1 2 3 525 37 60 80溫度(C)5.0 5.56.0 6.57.0 7.5反應(yīng)時間（h）0.5 1 2 3 5過夜圖2反應(yīng)溫度(a)、pH值(b)、反應(yīng)時間(c)及金屬離子與DTPA雙酸酐摩爾比(d)對螯合效率的影響Fig.2Theeffectoftemperature(a),pH(b),time(c)andmoleratioofmetaliontoDTPAdianhydride(d)onchelationrate從圖2可以看出，優(yōu)化后的最佳條件為：溫度37°C、pH6、反應(yīng)時間2h、金屬離子濃度是肽段的5倍，此條件同樣可適用于其它稀土金屬元素。在此條件得到的Y、Tb、Ho、Tm和Lu的質(zhì)譜圖見圖3,其標(biāo)記率見表3。

1OD90-30706050403020*1D1233.5375I147.74S2b1OOn13033065<>O80-1OD90-30706050403020*1D1233.5375I147.74S2b1OOn13033065<>O80-GO1147433150-c4030-207723566臨723.E[1278S538839424632102962141201340911355.33520$召0~1240!4>o 1 ideiw-id1309M72016002.6E*41.GE*<4J1理7日日巳2曰E6"9124090-BO706050-4030-7725695%8556241S8O尹482 110310450730"491O-8350886e9316419T9OGSGL/X1-一~n▼一1OGO142016001OOn908070605040-圖3標(biāo)1O-準(zhǔn)肽段（LRRASLG）與稀土金矚Y（a）、Tb（b）、珊L?gqQ6血 準(zhǔn)肽段（LRRASLG）與稀土金矚Y（a）、Tb（b）、珊L?gqQ6血 . 買70。83278應(yīng)1OO表35種單同位素元素與8769859肽段LRRASLG標(biāo)記率131944573-2E+-*Table3Theratioof5singleisotopeelementscombiningwithLRRASLG8(11.0223 1147.5431金屬元素名稱3020IOTbLRRA$LG-DTPA血z,1+)LRRASLG-DTPA-M(m/z,1+)762.0009700 '1OO表35種單同位素元素與8769859肽段LRRASLG標(biāo)記率131944573-2E+-*Table3Theratioof5singleisotopeelementscombiningwithLRRASLG8(11.0223 1147.5431金屬元素名稱3020IOTbLRRA$LG-DTPA血z,1+)LRRASLG-DTPA-M(m/z,1+)762.0009700 '1OZ153fe3lI 1JO苗邑卩.1"號翼961呵147.4331”“"虬1169.5203233.637E- 1701B14CM.35291303.30651€OO75.672.8Ho1147.64151309.547289.9Tm1147.56181313.557092.5Lu1147.54311319.445768.9圖3表明，不同金屬元素與同一肽段的結(jié)合率不同，其中Y和Tb的標(biāo)記率較為相近，Ho和Tm的標(biāo)記率較為相近（見表3）。因此，在接下來試驗中，將Y和Tb作為一組用于雙金屬標(biāo)簽標(biāo)記，Ho和Tm作為一組用于雙金屬標(biāo)簽標(biāo)記，只有Lu標(biāo)記率較低，且雜峰較多，不宜與其它元素配對，因此，將主要對Y、Tb、Ho和Tm四種元素進(jìn)行研究。3.3金屬標(biāo)記物的穩(wěn)定性考察金屬標(biāo)簽的穩(wěn)定性對于其在實際樣品中的應(yīng)用至關(guān)重要，因此該質(zhì)量標(biāo)簽要具備一定的穩(wěn)定性。Tb和Y的穩(wěn)定性已在劉［7研究中考察，下面僅對Tm和Ho進(jìn)行研究。將標(biāo)記好的樣品放于4°C一周后（見圖4a和圖4e）進(jìn)行質(zhì)譜檢測，仍有95%（峰強(qiáng)度）的標(biāo)記產(chǎn)物被檢測到。在放置兩周、三周和四周后再分別檢測，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸下降，金屬離子標(biāo)記的目標(biāo)峰比例逐漸下降，肽段的質(zhì)譜峰和第一步反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜峰逐漸增強(qiáng)。下圖是銩元素和欽元素在4C放置一周、兩周、三周和四周的質(zhì)譜圖的分析結(jié)果。

一津b1147.844213357765一津b1147.8442133577651045827811698296丨嚴(yán)"7625,472OO8S13137894e730.0176 855.48191031.94961147.5605|1171.519312654763J36337381471.358400880106012401420 16C圖4稀土金屬銩(Tm)標(biāo)記產(chǎn)物放置一周(a)、兩周(b)、三周(c)、四周(d)

和欽(Ho)標(biāo)記產(chǎn)物放置一周(e)、兩周(f)、三周(g)和四周(h)的質(zhì)譜圖的質(zhì)譜圖Fig.4TheMSspectraofThulium(Tm)labeledafteroneweek(a),twoweeks(b),threeweeks(c),fourweeks(d)

andHolmium(Ho)labeledafteroneweek(e),twoweeks(f),threeweeks(g)andfourweeks(h)從圖4可以看出，將標(biāo)記有金屬的質(zhì)量標(biāo)簽在4°C放置一段時間后，由于溫度的降低，質(zhì)量標(biāo)簽會有部分降解，且隨著放置時間的進(jìn)一步延長，尤其超過兩周，質(zhì)量標(biāo)簽的分解逐漸增強(qiáng)，標(biāo)簽的峰強(qiáng)度逐漸降低，生成的中間產(chǎn)物的峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。因此，若將標(biāo)記好的標(biāo)簽用于定量研究，則放置時間不能超過兩周。3.4金屬交換現(xiàn)象的考察當(dāng)質(zhì)量標(biāo)簽含有兩種或更多不同金屬元素的標(biāo)簽時，除考慮各個絡(luò)合物的穩(wěn)定性之外，還要考慮各金屬元素之間的交換標(biāo)記問題。由于不同金屬元素與DTPA雙酸酐的結(jié)合常數(shù)不完全相同，當(dāng)該常數(shù)相差較大的兩種金屬的絡(luò)合物在同一體系中時，螯合常數(shù)大的金屬離子可能將螯合常數(shù)小的金屬離子從其絡(luò)合物中置換出來，影響標(biāo)記。13131327as13131327as“13091326130511801, 圖6稀土金屬欽和銩、釔和鋱交換實驗質(zhì)譜圖：將欽元素加入到銩標(biāo)簽(a)、將銩元素加入到欽標(biāo)簽中(b)、

將釔元素加入到鋱標(biāo)簽中(c)、將鋱元素加入到釔標(biāo)簽中(d)Fig.6TheMSspectraofrareearthmetalHolmiumandThulium,TerbiumandYttriumaftercrosslabeled:addHotoTmlabels(a),addTmtoHolabels(b),addYttriumtoTerbiumlabels(c),addTerbiumtoYttriumlabels(d)為此，分別將金屬欽的鹽酸鹽加入到標(biāo)記好的銩-肽溶液中(圖6a)，將金屬銩的鹽酸鹽加入到欽-肽溶液中(圖6b),兩者都放置24h后,Ho和Tm的交換結(jié)果表明，只有很少(小于3%)的金屬發(fā)生了置換(圖6a中標(biāo)簽1309.1326置換1313.1331,圖6b中標(biāo)簽1313.1327置換1309.1311)。同樣，將金屬Y的鹽酸鹽

加入到標(biāo)記好的Tb-肽溶液中（圖6c）,將金屬Tb的鹽酸鹽加入到Y(jié)-肽溶液中（圖6d）,置換24h,Tb和Y的交換結(jié)果表明，只有很少（小于3%）的金屬發(fā)生了置換（圖6c中為標(biāo)簽1233.4326置換1303.4175,圖6d中為標(biāo)簽1303.4835置換1233.4670）。以上結(jié)果表明結(jié)合常數(shù)是選擇金屬元素的一個重要指標(biāo)，既要保證該常數(shù)足夠大（有足夠穩(wěn)定性），又要保證相互之間相差不能太大（避免交換標(biāo)記）。3.5金屬標(biāo)記物的色譜行為考察劉［7巳對Y和Tb的共洗脫進(jìn)行過考察，發(fā)現(xiàn)兩金屬對同一肽段標(biāo)記的質(zhì)量標(biāo)簽是共洗脫。本文考察了酎不同金屬離子標(biāo)記的肌紅蛋白酶切肽段LC-MS的共洗脫質(zhì)譜圖金屬Tb、Ho酎不同金屬離子標(biāo)記的肌紅蛋白酶切肽段LC-MS的共洗脫質(zhì)譜圖金屬Tb、Ho、Tm和Lu與肌紅蛋白（myoglobin,MYO）酶切肽段的洗脫行為，首先對肌紅蛋白酶切肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后將標(biāo)記有不同稀土金屬的肽段1、2、3和4經(jīng)LC-MS分析，如圖7所示。Fig.7TheanalysisofthelabeledpeptidemixtureofMYObyLC-MS19.66\23.5127.20311335.0111i111111Ti11iTiI圖7表明，標(biāo)記有金屬Tb、Ho、Tm和Lu的同一肽段為共洗脫，洗脫時間除Lu為22.14min外，其余均為21.90min,從洗脫時間結(jié)果再次說明，稀土元素Lu不適合與其它元素配對用于標(biāo)記。實驗結(jié)果表明基于稀土元素標(biāo)記可以用于蛋白質(zhì)組定量分析。將標(biāo)記有不同稀土金屬離子的肽段混合物通過LC-MS分析鑒定，實驗結(jié)果顯示標(biāo)記有不同稀土金屬離子的同一肽段在液相分離中能夠被共洗脫。3.6檢測限為了考察稀土元素標(biāo)記后肽段的檢測限，本實驗將銩和鈥標(biāo)記樣品分別稀釋為不同的濃度梯度（見表4），然后進(jìn)行MALDI源質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖9和圖10所示。表4銩和鈥稀釋后的濃度梯度Table4ThegradientconcentrationofTmandHoafterdeliquation金屬元素標(biāo)簽銩鈥a432398b43.239.8濃度梯度c21.619.9(pmol/“L)d4.323.98e2.161.99f1.081.00

1313.6255131407961147701413356074131381451147760E63211；84.06011240 1420b1147.9974““8878077-卿幫21 1071.9530嚴(yán)8394411313.6255131407961147701413356074131381451147760E63211；84.06011240 1420b1147.9974““8878077-卿幫21 1071.9530嚴(yán)839441008801060124Q1420161313.9659131373431147.7938251^177705；0 1240Mass(inzl700880Fig.9TheMSspectraofrareearthmetalThulium(Tm)labeledatdifferentconcentration1309.439913096793142013096835■jJujIll他bu申川艸泄d十濃度時的質(zhì)譜睥爲(wèi)嘗怖13096793142013096835Fig.10TheMSspectraofrareearthmetalHolmium(Ho)labeledatdifferentconcentration將銩和欽兩元素質(zhì)量標(biāo)簽的濃度分別從432pmol/吐和398pmol/yL稀釋到1.08pmol/吐和1.00pmol/yL（見表4）,從對應(yīng)的質(zhì)譜圖可以看出，在稀釋不同倍數(shù)后，質(zhì)譜峰強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)濃度分別達(dá)到1.08pmol/yL和1.00pmol/吐時，目標(biāo)峰變得很弱，而此時噪音峰強(qiáng)度已明顯增強(qiáng)。因此可以得出MALDI源質(zhì)譜對稀土金屬標(biāo)簽的檢測限可達(dá)近1pmol/yL。3.7動態(tài)范圍不同金屬元素與肽段標(biāo)記后在質(zhì)譜中的響應(yīng)程度不同，同時該響應(yīng)程度隨樣品濃度變化會有差別。而且當(dāng)兩種不同金屬標(biāo)記的樣本在同一體系中時，相互之間會有離子抑制效應(yīng)。諸多因素共同作用，使得多元素標(biāo)記時，理論比例與實測比例有較大差別。為了考察稀土金屬的離子抑制效應(yīng)，將兩種元素分別標(biāo)記的肌紅蛋白的酶切肽段溶液按不同比例（摩爾比）混合，進(jìn)行質(zhì)譜分析。劉⑺已對稀土金屬元素Tb和Y的動態(tài)范圍做過研究，本文僅對Ho和Tm進(jìn)行考察。首先將Ho和Tm與MYO酶切肽段進(jìn)行標(biāo)記，然后將標(biāo)記好的肽段按照比例（Tb/Y）分別為1:10、1:6、1:3、1:1、3:1、6:1、10:1（摩爾比）進(jìn)行混合，進(jìn)行MALDI-TOFMS分析，測定兩金屬標(biāo)簽的實際比例。實驗結(jié)果見表5。表5肌紅蛋白酶切肽段ALELFR與Tb/Y、Ho/Tm離子抑制效應(yīng)Table5TheionsuppressioneffectofpeptideALELFRfrommyoglobinchelatingwithrareearthmetalsTb/Y,Ho/Tm理論比例1:101:61:31:13:16:110:1測得比例Tb/Y0.200.390.501.654.558.1819.46(62qt:6elA}ora(62qt:6elA}ora」pa>A」(psqoHo/Tm11.163.466.7913.68Thecreticalratio結(jié)果表明，隨著兩金屬濃度差的變化，兩對金屬的實測比例與理論加入比例差異會增大，而且當(dāng)兩者比例相差越大，由此帶來的差異也越大。由于一般在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，當(dāng)差異比值大于2時，即認(rèn)為是顯著差異，所以，該結(jié)論并不影響差異較大的蛋白質(zhì)組的比較分析。3.8￡-氨基封閉金屬元素與標(biāo)準(zhǔn)肽段LRRASLG標(biāo)記，不存在側(cè)鏈氨基的干擾問題，但對于蛋白質(zhì)酶切肽段，因含有￡-氨基，而DTPA雙酸酐與氨基的反應(yīng)沒有選擇性，即會與￡-氨基反應(yīng)，又由于位阻等因素的影響，該反應(yīng)進(jìn)行不完全，因此會使定量結(jié)果誤差顯著增大。所以，在進(jìn)行金屬離子螯合之前，必須將￡-氨基進(jìn)行封閉［13。］胍基化反應(yīng)封閉賴氨酸的￡-氨基的優(yōu)點一是反應(yīng)完全；二是由于高精氨酸的胍基(pKa=12.48)比賴氨酸的氨基(pKa=10.48)有更強(qiáng)的堿性，所以更容易結(jié)合質(zhì)子帶上正電荷，能提高以K結(jié)尾肽段在MALDI源質(zhì)譜分析中的信號強(qiáng)度，因此，選擇胍基化反應(yīng)封閉賴氨酸的￡-氨基。其反應(yīng)條件為：pH11.0；胍基化試劑濃度：100mM；反應(yīng)溫度：37°C；反應(yīng)時間：4h。實驗結(jié)果見圖11。圖11馬心肌紅蛋白酶切肽段肌基化修飾前(a)、圖11馬心肌紅蛋白酶切肽段肌基化修飾前(a)、后(b)質(zhì)譜圖Fig.11TheMSspectraofpeptidesfromMYGbeforeguanidination(a)andafterguanidination(b),respectively由圖11可知，在此條件下，含有賴氨酸的肽段完全被封閉。另外，馬心肌紅蛋白酶切肽段在胍基化修飾前，只有1606.7694和1884.9136豐度較強(qiáng)(見圖11a)，而胍基化修飾后，無論高豐度峰個數(shù)和峰整體強(qiáng)度都有明顯提高(見圖11b)。因不含￡-氨基而沒有胍基化修飾的1606.7694峰強(qiáng)度沒有發(fā)生明顯變化。另外，還選擇a-乳白蛋白和卩-乳白蛋白酶切肽段進(jìn)行胍基化修飾，結(jié)果列于表6中。表6a-乳白蛋白和A乳白蛋白酶切肽段肌基化修飾結(jié)果Table6Peptidesofa-lactalbuminandP-lactalbuminmodifiedbyguanidinea-乳白蛋白卜乳白蛋白肽段序列胍基化前肽段質(zhì)量胍基化后肽段序列胍基化前肽段質(zhì)量胍基化后肽段質(zhì)量胍基化率肽段質(zhì)量胍基化率VIISAPSADAPM2213.10932255.8267100.00%GITWKEETLM2081.02592123.6978100.00%FVMGVNHEKEYLENPKGAAQNIIPASTG1369.74341411.583995.33%TGQAPGFTYT1712.82381796.8598100.00%AAKDANKNKVIPELNGK869.5091911.3527100.00%CAQCHTVEK1018.44441060.3987100.00%GGKTVDGPSGK760.3835802.3223100.00%EDLIAYLKK964.53491006.4217100.00%YDNSLK739.3621781.29596.86%MIFAGIK779.4484821.3643100.00%AAFNSGK694.3518736.2816100.00%YIPGTK678.3821720.314996.58%FHGTVK688.3777730.3097100.00%____a-乳白蛋白和卩-乳白蛋白酶切肽段胍基化修飾的結(jié)果表明（見表6）,除了肽段YDNSLK、YIPGTK和GAAQNIIPASTGAAK胍基化率相對較低外（仍大于95%）,其余肽段的胍基化效率達(dá)到100%。因此，胍基化反應(yīng)封閉肽段中賴氨酸的￡-氨基的方法，可用于稀土元素標(biāo)記前樣本處理。4結(jié)論本文通過選擇稀土金屬鋱（Tb）、釔（Y）、銩（Tm）、欽（Ho）和镥（Lu）對標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，對標(biāo)記效率、色譜行為、標(biāo)記穩(wěn)定性和離子交換等現(xiàn)象進(jìn)行了考察，結(jié)果表明金屬元素標(biāo)記效率較高，而且在4°C放置一周后仍有95%被檢測到；標(biāo)有不同金屬元素的肽段可以在色譜分離時共洗脫；在結(jié)合常數(shù)相差不大（差值小于1）的情況下，金屬交換標(biāo)記現(xiàn)象可以忽略，不會對標(biāo)記產(chǎn)生影響；標(biāo)記有金屬元素的肽段在MALDI源質(zhì)譜中的響應(yīng)度可達(dá)pmol/yL；在兩種金屬濃度差不超過6倍時，由離子抑制帶來的影響較小，不影響差異較大的蛋白質(zhì)組的比較分析；對于￡-氨基的干擾問題，通過胍基化修飾進(jìn)行有效的封閉。這些為目前金屬標(biāo)記應(yīng)用于蛋白質(zhì)相對定量提供了新的選擇。另外，該標(biāo)記方法若與電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductivelycoupledplasmamassspectrometry,ICP-MS）結(jié)合，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對定量，而ICP-MS】14］具有對極低含量元素實施精確定量的優(yōu)勢（可達(dá)10-15），這使得該方法在蛋白質(zhì)絕對定量研究中顯示出巨大的潛力。References參考文獻(xiàn)GevaertK,ImpensF,GhesquiereB,DammePV,LambrechtsA,VandekerckhoveJ.Proteomics,2008,8:4873?4885LIWei（李偉）.CHEMISTRYOFLIFE（生命的化學(xué)）,2006,26（5）:453~456DeSouzaL,DiehlG,RodriguesMJ,GuoJZ,RomaschinAD,ColganTJ,MichaelSiuK.W.JournalofProteomeResearch,2005,4:377?386ZhangGA,SpellmanDS,SkolnikEY,NeubertTA.JournalofProteomeResearch,2006,5:581?588QIANLin-Yi（錢林藝）,YINGWan-Tao（應(yīng)萬濤）,LIUXin（劉新）,LUZhuang（盧莊）,CAIYun（蔡耘）,HEJianyong（何建勇），QIANXiaohong（錢小紅）.ChineseJ.Anal.Chem.（分析化學(xué)），2007,35（2）:161~165WhetstonePA,ButlinNG,CorneillieTM,MearesCF.BioconjugateChem.2004,15:3?6LiuHL,ZhangYJ,WangJL,WangD,ZhouCX,CaiY,QianXH.AnalChem,2006,78:6614?6621CorneillieTM,WhetstonePA,FisherAJ,MearesF.J.AM.CHEM.SOC.2003,125,3436?3437SHENGFeng（圣鋒）,HEWeiwei（賀巍巍）,LIUZhaofei（劉昭飛）,ZHAOHuiyun（趙慧云）,JIABing（賈兵）,WANGFan（王凡）.JournalofNuclearandRadiochemistry（核化學(xué)與放射化學(xué)）,2008,30（2）:70~74LINHongjun（林虹君）,WEIJunying（衛(wèi)軍營）,JIAWei（賈偉）,ZHANGYangjun（張養(yǎng)軍）,QIANXiaohong（錢小紅）,CAIYun（蔡耘）.JournalofChineseMassSpectrometry（質(zhì)譜學(xué)報），2010,31,5:283?290AhrendsR,PieperS,AndreasK,WeisshoffH,HamesterM,LindemannT,SchelerC,LehmannK,TaubnerK,LinscheidMW.Molecular&CellularProteomics,2007,6（11）:1907?1916ZHOUTong-Hui（周同惠）,WANGEr-Kang（汪爾康）,LUWan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