rrhpi-pqe40ecolim15高效表達(dá)系統(tǒng)的建立及發(fā)酵條件優(yōu)化

rrhpi-pqe40ecolim15高效表達(dá)系統(tǒng)的建立及發(fā)酵條件優(yōu)化

廣泛用于構(gòu)建互補(bǔ)基因的細(xì)菌，并獲得大量外源基因的產(chǎn)物。用質(zhì)粒pQE-40構(gòu)建了(His)6-Arg-Arg-人胰島素原[(His)6-Arg-Arg-humanproinsulin,RRhPI]的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。RRhPI經(jīng)過復(fù)性酶切等下游純化工藝可加工成具有天然生物活性的重組人胰島素。因此,探索在重組大腸桿菌中外源基因RRhPI表達(dá)的發(fā)酵工藝,使之高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng),最終得到高表達(dá)的RRhPI,是提高重組人胰島素產(chǎn)率的方法之一。實(shí)現(xiàn)基因工程菌的工業(yè)化生產(chǎn),除了構(gòu)建高效的載體-宿主系統(tǒng)外,基因工程菌的發(fā)酵過程控制也十分重要。為此,特采用正交優(yōu)化工藝探索了基因工程菌(RRhPI-pQE40E.coliM15)高密度發(fā)酵的影響因素和發(fā)酵工藝。1實(shí)驗(yàn)部分1.1微生物E.coliM15及質(zhì)粒pQE-40(QIAGEN),胰蛋白胨(Oxoid)和酵母浸出汁(上海棱光酵母制品有限公司);氨芐青霉素(華北制藥股份有限公司);卡那霉素(AMRESCO分裝);異丙基-β-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG,BBI分裝);低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(上海東風(fēng)生物技術(shù)有限公司);其余為國產(chǎn)分析純。1.2rrhpi-pqe-colim15濕菌體的制備1.2.1重組體RRhPI-pQE40E.coliM15的構(gòu)建及篩選以人胰腺cDNA文庫為模板,特定設(shè)計(jì)的寡核苷酸段鏈為引物,PCR擴(kuò)增hPI的編碼序列;hPI基因pQE-40質(zhì)粒分別被限制性內(nèi)切酶BamHI和HindⅢ同時(shí)酶切產(chǎn)生黏性末端;在低溫(16℃)條件和T4DNA連接酶的作用下,hPI基因和pQE-40質(zhì)粒通過黏性末端互補(bǔ)形成重組DNA;重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞M15。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化單克隆,在LB/AK培養(yǎng)基(氨芐青霉素100μg·ml-1和卡那霉素50μg·ml-1)中進(jìn)行培養(yǎng),用0.5mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。1.2.2細(xì)菌的搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)水平下,用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和比濁法測(cè)RRhPI-pQE40E.coliM15的生長曲線。用接種環(huán)挑取斜面保存的RRhPI-pQE40E.coliM15一環(huán)接種于3mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間。取100μl菌液接種于5mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間即可?；罨姆N子可在4℃下保存數(shù)周待用。將5ml活化種子轉(zhuǎn)接到50ml優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間。取50ml經(jīng)一級(jí)發(fā)酵擴(kuò)培后的菌液轉(zhuǎn)接到500ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間后加入IPTG誘導(dǎo)人胰島素原的表達(dá),繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一段時(shí)間后結(jié)束發(fā)酵。3×103r·min-1離心15min,沉淀即得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,于-20℃保存。采用正交法,結(jié)合搖瓶發(fā)酵工藝的前期研究,選取搖瓶培養(yǎng)條件中7個(gè)主要因素進(jìn)行兩水平正交優(yōu)化,7個(gè)因素為種子活化方式、搖床轉(zhuǎn)速(通風(fēng)量)、IPTG誘導(dǎo)溫度、接種量、IPTG添加量、誘導(dǎo)時(shí)間和補(bǔ)料方式。以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標(biāo)量考察條件優(yōu)化的效果。選用L8(27)安排,進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn),對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,優(yōu)化出最佳實(shí)驗(yàn)條件,并做3次水平重復(fù)試驗(yàn),分別測(cè)定每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量、發(fā)酵液的A600及每升培養(yǎng)基收獲包涵體的量。IPTG誘導(dǎo)基因工程大腸桿菌表達(dá)RRhPI。對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間的影響進(jìn)一步做了分析,基因工程菌在三角搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達(dá)情況。1.2.3細(xì)胞的2種破碎方法其一是溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞。發(fā)酵所得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,懸浮于適量緩沖液A(50mmol·L-1Tris-HCl、0.5mmol·L-1EDTA、50mmol·L-1NaCl、5%甘油、0.1～0.5mmol·L-1DTT、pH7.90)中,加入溶菌酶(5mg·g-1濕菌體),室溫或37℃振蕩2h。在冰浴中超聲(10s×30),每次間隔20s,功率200W。其二是超聲破碎細(xì)胞。大腸桿菌濕菌體懸浮于適量的緩沖液A中,充分溶解,冰浴超聲(40s×10),每次間隔30s,功率200W。兩種破碎方法所得包涵體洗滌后作SDS。洗滌時(shí)均先后用含2mol·L-1尿素的緩沖液和含2%脫氧膽酸鈉(DOC)的緩沖液各洗滌1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次。1.2.4包涵體的3種洗滌方法溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞的裂解液于4℃、1.4×104r·min-1離心15min,收集沉淀。洗滌方法一是將此沉淀用2mol·L-1尿素的緩沖液充分溶解,離心收集沉淀;沉淀再用2%DOC的緩沖液洗滌,離心,所得沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵體,于-20℃保存。方法二則用緩沖液充分洗滌沉淀兩次,收集沉淀保存。方法三用2%DOC的緩沖液洗滌1次。再用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次,離心收集沉淀保存。取上述不同方法洗滌的沉淀,用SDS檢測(cè)洗滌效果。1.3結(jié)果1.3.1rrbol-pqe40的rr公式用于構(gòu)建1.3.2rrhpi-pqe.colim15在iptg的誘導(dǎo)表達(dá)在搖瓶培養(yǎng)水平下,采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵RRhPI-pQE40E.coliM15,培養(yǎng)4h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,而且對(duì)數(shù)生長期可延至17h。采用優(yōu)化出的最佳實(shí)驗(yàn)條件做3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見表1。綜合每升培養(yǎng)基所收獲濕菌體的量(wetweight/g·L-1)和發(fā)酵液的A600兩個(gè)指標(biāo),選取關(guān)鍵因素的最優(yōu)條件,結(jié)果表明搖床轉(zhuǎn)速(即通風(fēng)量)與補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大,IPTG的誘導(dǎo)時(shí)間和添加量次之。正交試驗(yàn)所得菌體經(jīng)溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞后得到的包涵體SDS的結(jié)果見圖3。RRhPI-pQE40E.coliM15表達(dá)的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在,其分子大小約為13kD,由圖3可知,在正交實(shí)驗(yàn)條件下2、3、7、8包涵體的表達(dá)量較高。RRhPI-pQE40E.coliM15在搖瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達(dá)情況(圖4)。結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15在IPTG誘導(dǎo)4～5h時(shí),富含包涵體的濕菌體(約24kD)收率較高,相應(yīng)的目的蛋白表達(dá)量較高,繼續(xù)誘導(dǎo)并未使?jié)窬w表達(dá)量有所提高。因此,誘導(dǎo)3.5～4h既有利于富含包涵體的濕菌體及目的蛋白的表達(dá),又可縮短發(fā)酵時(shí)間,簡化生產(chǎn)工藝。2.3細(xì)胞破碎方法我們比較了溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞和超聲破碎細(xì)胞兩種方法,并進(jìn)一步比較了3種包涵體的洗滌方法(圖5)。結(jié)果說明“1.2.3”項(xiàng)中破碎方法一較好,即用溶菌酶和超聲破碎結(jié)合可徹底破碎細(xì)胞,并使表達(dá)產(chǎn)物包涵體充分溶出?！?.2.4”項(xiàng)中方法一的洗滌效果優(yōu)于方法二和三,即采用變性劑2mol·L-1尿素及離子型去污劑2%DOC洗滌的效果較好。3發(fā)酵罐培養(yǎng)的菌株活性及菌體表達(dá)利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的基因工程菌的發(fā)酵工藝不同于傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝,生物工程菌發(fā)酵的目的是希望獲得大量的外源基因產(chǎn)物,盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表達(dá)不僅涉及宿主、載體和目的基因三者的相互關(guān)系,而且與其所處環(huán)境的條件也密切相關(guān)。因此,需要對(duì)影響外源基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析,探索適合外源基因表達(dá)的發(fā)酵工藝。重組大腸桿菌的高密度發(fā)酵,可降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。我們通過對(duì)RRhPI-pQE40E.coliM15發(fā)酵條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速與補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響最大。搖床轉(zhuǎn)速與發(fā)酵過程中氧氣的供給有直接的關(guān)系,轉(zhuǎn)速越高,越能滿足高密度發(fā)酵中工程菌劇烈生長繁殖所需的氧氣量;及時(shí)補(bǔ)料則可相對(duì)延長工程菌的對(duì)數(shù)生長期,從而增加菌體數(shù)量,達(dá)到高密度發(fā)酵的目的;加入一定量的培養(yǎng)基,可及時(shí)起到稀釋作用,消除代謝產(chǎn)物的抑制作用,從而促進(jìn)工程菌的生長繁殖。使用發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí),可以通過攪拌器和加大通氣量來保證細(xì)菌生長發(fā)酵所需的溶氧;發(fā)酵罐發(fā)酵采用流加式培養(yǎng),可控制流加的時(shí)機(jī)和模式等,更有效地保證了菌體生長繁殖過程中營養(yǎng)物質(zhì)的及時(shí)補(bǔ)充以及代謝產(chǎn)物的流出與稀釋,促進(jìn)了工程菌的高密度發(fā)酵。因此,可以預(yù)見:在優(yōu)化的條件下用發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體可使目的蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步提高。溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞結(jié)合了酶法破碎細(xì)胞與機(jī)械破碎細(xì)胞的方法,既可徹底破碎細(xì)胞又可避免使用DNAaseⅠ,降低了成本,簡化了工藝,同時(shí)也減少了外源蛋白的引入。在洗滌包涵體時(shí)先后采用2mol·L-1尿素的緩沖液和2%DOC的緩沖液洗滌,低濃度的變性劑和離子型的去污劑的使用,洗除了大部分的雜蛋白(尤其是脂類和膜蛋白),提高了包涵